PCR技术用于基因治疗及的进展技术报告.docVIP

分 子 生 物 学 课 程 论 文 题 目 PCR技术用于基因治疗及研究的进展 班 别 学号 姓 名 成 绩 PCR技术用于基因治疗及研究的进展 摘要 PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作基础。PCR技术使微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。[1]本文在简述PCR技术原理的基础上,综述了PCR在基因治疗和生物研究方面的概况。 关键词 PCR技术 聚合酶链式反应 DNA体外扩增 基因治疗 前言 1983年KaryMullis发明了一种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,是体外扩增DNA序列的技术.原来的PCR只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增到序列未知的新基因。PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。PCR原本是一种定性的方法只能回答样品中有无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定，即回答样品中原始模板的确切数目。PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCR。再加上PCR方法与其他方法联合应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十多种之多。PCR技术建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学的研究中。PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展。[2]由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。 PCR技术的发展简史[3] 1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首 次证实了DNA的半保留复制。 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。 20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。 PCR技术原理及操作 PCR的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模版，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完新的DNA合成，不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。 PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR的基本反应由三个步骤组成：1变性，通过加热模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除；