雙向荧光原位杂交手册(2_dimension-FISH_protocol).docVIP

组织（细胞）间期核2-dimension DNA FISH实验步骤 Note：依照本protocol 进行该实验两大关键因素： 一是样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等； 二是BAC探针的制备纯化，包括BAC的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。 一、组织间期核制备过程 组织放入平皿中，加含50ul双抗的PBS 5ml泡10min。 用PBS洗一下，剪碎。 加胶原酶5ul和培养液5ml放入37度过夜。（该步骤只针对不易释放游离细胞的组织） ——过夜消化则以上操作均需在超净台进行，以防污染 （细胞：PBS洗两遍，消化细胞，收集，PBS洗一遍，细胞数太少则不洗）。 4. 将组织碎块（细胞）在15ml离心管中加0.075M KCL 10ml，37 ℃ 水浴锅内低渗30min。 取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混匀，室温1000rpm离心10min弃上清。 加固定液10ml混匀后，室温静置30min，离心弃上清。 步骤6重复三次后加入固定液1.5ml，混匀后静置1~2min，将上层较为清亮的细胞悬液约1ml转于1.5 ml EP管内4℃存放。（长期可置-20℃冻存） 点片：将适当细胞密度的悬液0.2-1μl点于玻片上，用钻石笔在玻片