GM-CS在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.docVIP

GM-CSF在特发性肺纤维化大鼠肺组织中的表达及其可能的作用机制 蔡欣 梁标 [摘要] 目的：通过阐明肺纤维化过程中粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平在肺纤维化大鼠肺组织的表达，探讨GM-CSF在特发性肺纤维化发病机制中的作用。方法：40只健康成年雌性大鼠随机分为模型组20只和正常对照组20只，模型组气管内一次性注射博来霉素５ｍｇ·ｋｇ-1造肺纤维化模型，对照组气管内注射生理盐水，各组均于第1，3，7，14天分别处死5只，对大鼠肺组织予HE染色，光镜观察病理改变；碱水解法测定大鼠肺匀浆中的羟脯氨酸含量；ELISA法测定GM-CSF在肺组织匀浆中的水平。结果：模型组大鼠肺泡炎、肺纤维化的程度均明显高于对照组；模型组肺组织中的羟脯氨酸含量明显高于对照组；正常大鼠肺组织中GM-CSF含量有一定水平，模型组的大鼠肺匀浆中的GM-CSF水平在第3天迅速增高并达到高峰，此后逐渐下降，但第7天和第14天时仍明显高于对照组(p0.01)。结论：GM-CSF在肺纤维化模型大鼠肺组织中明显增高，可能在肺纤维化发病机制中起重要作用。 [关键词]肺纤维化；博来霉素；GM-CSF 前言 特发性肺纤维化（IPF）是一种严重影响人们生活质量和生命健康的疾病，其发病机理复杂，与诸多因素有关，发病过程中有多种炎症细胞参与(1)。粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种来源广泛细胞因子，可促进多种包括单核巨噬细胞，中性粒细胞在内的多种炎症细胞游走(2)。本研究通过建立大鼠肺纤维化模型，将大鼠分为用ELISA 法测定GM-CSF在肺纤维化大鼠肺组织中的表达,。 方法 实验动物 40只3月龄近交系健康成年雌性SD大鼠(SPF级)（本校实验动物中心提供），体重200±20g。动物实验室温度22±2度,湿度54%. 二、药剂与试剂 1、羟脯氨酸（Hyp）测试盒及羟脯氨酸测试前处理碱水解试剂 购自南京建成生物工程研究所。 2、博来霉素 由日本化药株式会社生产 3、GM-CSF ELISA试剂盒 由美国Biosource生物工程公司生产。 4、非变性裂解缓冲液 购自北京五洲元业生物工程有限公司。 三、方法： （1）将40只大鼠随机分为两组，分别为模型组和正常对照组，①模型组予2％戊巴比妥（30mg/kg）腹腔内注射后，逐层暴露气管，气管内一次性注入博来霉素5mg·kg-1，注射后将大鼠直立旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合伤口。②对照组气管内给予与模型组博来霉素等量的生理盐水。每组分别在1，3，7，14天各处死5只。 动物处死后进行以下操作： 肺组织病理标本的制备：将心肺完整取出，结扎左主支气管，分离左肺，取左下肺用10%福尔马林固定，石蜡包埋，用于病理观察。取左上肺于液氮保存。制成肺细胞匀浆用于GM-CSF ELISA测定，取右肺于液氮保存，用于羟脯氨酸测定(3)。 （2）病理学检查： 根据Szapiel的方法确定肺泡沿河肺纤维化的程度。用ＨＥ染色的病理切片将肺泡炎分为４期：（1）无肺泡炎；(2)轻度肺泡炎(Ⅰ级)；（3)中度肺泡炎(Ⅱ级)；(4)重度肺泡炎(Ⅲ级)(4)。 （3）肺组织匀浆GM-CSF测定： 取组织块(200mg)在冰冷的生理盐水中漂洗，剪碎，将剪碎的组织倒入玻璃组织匀浆器中，加入非变性裂解缓冲液1ml，一起倒入匀浆管中匀浆，使组织裂解析出蛋白，将捣杆上下转动研磨，充分研碎，使组织匀浆化。将制备好的10%匀浆用低温离心机12000r/min左右离心10分钟，取上清液，弃下面沉淀。上清液用ELISA法测定GM-CSF，严格按说明书操作(5)。 （4）肺组织羟脯氨酸测定：取右肺，沉重后剪碎，每克肺组织加无菌生理盐水４ml，以3000r/min离心10min，过滤得上清液，用碱水解法测定羟脯氨酸含量。严格按说明书操作。 （5）统计方法： 实验数据用用数据用X±S表示表示，用SPSS统计软件进行t检验。P0.05，差异有显著意义，P0.01差异有非常显著意义。 结果 1，一般情况 治疗前各组体重差异无显著性，模型组组第7、14天组体重均较对照组明显下降，各相应天数模型组组大鼠进食，活动等一般情况均较对照组差。 2，肺组织病理变化 对照组：第1-3天肺间质中有少量巨噬细胞、中性粒细胞。淋巴细胞等炎症细胞浸润，肺泡隔略增宽，此后无明显异常。模型组：第1天可见肺间质和肺泡腔内有部分中性粒细胞、肺泡巨噬细胞渗出，肺泡壁略增宽；第3天可见肺泡壁水肿，肺内中性粒细胞、淋巴细胞增多，尚有部分嗜酸性细胞；第7天可见肺间隔增厚，局部肺泡塌陷，有大量炎症细胞渗出，嗜酸性细胞较第3天多，成纤维细胞、毛细血管开始增生；第14天肺泡眼开始消退，中性粒细胞显著减少，肺间质成纤维细胞进一步增生，纤维组织呈网状，絮状分布于气管周围及间质中。 3，肺组织羟脯氨酸