基因表达研究技术.pptVIP

如： 通过研究酵母从无氧环境到有氧环境时的表达谱，以及通过不同方式处理过的酵母菌的表达谱，发现约有5%的基因在表达量上有明显的变化。 阿尔茨海默病中，出现神经原纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱就有别于正常神经元，当病理形态学尚未出现纤维缠结时，这种表达谱的差异即可以作为分子标志直接对该病进行诊断。 转录组的研究应用于临床的的另一个例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应。 一般将选择性剪接分为： 外显子选择 内含子选择 互斥外显子 内部剪接位点 大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种成熟mRNA分子，因而只翻译成一种蛋白质。 有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接。 可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制, 是导致人类基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。 可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物。 已有实验研究表明，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用。尤其表现在神经系统和免疫系统，这与该类系统的功能多样性和反应敏感性是密切相关的。许多遗传疾病都与剪接繁盛异常紧密相关。据估计，导致疾病的变异中约15%会影响pre—mRNA的剪接。? * 刘亚鹏 朱瑞 生物工程141班 基因表达研究技术 刘亚鹏 朱瑞 生物工程141班 转录组测序 二. RNA选择性剪接技术 转录组：一个活细胞、组织或生物体内所有RNA的总和（包括mRNA、rRNA、tRNA及非编码RNA） 转录组学：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。 1.表达序列标签测序(EST) (1)原理 EST(Expressed Sequence Tag)是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单向一次测序获得的短的cDNA 部分序列，代表 一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ± 120bp 。EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。 （2）操作流程 组织样品mRNA的提取→逆转录合成 cDNA→构建cDNA文库→测序 通过对cDNA文库EST分析可以揭示用以构建cDNA文库的相应组织或细胞中mRNA的真正水平，因此可以通过大规模的EST分析研究表达图谱，以此得出特定组织类型在特定生理状态或是特定的发育阶段下基因表达情况。 （1）原理 基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。在此方法中，通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。 a.以biotinylated oligo(dT）为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶 ）酶切. b.将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. c.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增 d.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序. e.对标签数据进行处理 a.SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对已知基因进行量化分析。 b.SAGE也能应用于寻找新基因。 c.SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。 d.SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 （1） 以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术。 高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。 该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降, 以人类基因组测序为例, 上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码了人类生命密码,