现代基因工程_04将DNA引入活细胞解读.ppt

除了转化体系外，还有两种将DNA引入细胞的物理方法。 第一种：显微注射(microinjection) 使用一个非常精细的注射器将DNA分子直接注入将要被转化的细胞的核内。 这项技术最初用在动物细胞上，但随后却在植物细胞上取得了巨大的成功。 第二种：用高速的微型炮弹轰击细胞 通常使用的是包裹了DNA的金或钨的颗粒。 这些轰击微粒从特殊装置中发射出来，并射入到细胞中。 这项不寻常的技术称作生物弹，能够应用于多种不同的细胞。 4.5.2 整个有机体的转化 对于植物和动物，最希望得到的是转化的有机体。 尽管发展谷类和草等单子叶植物的再生过程中遇到了很多问题，但相对来说，从培养细胞再生出整个植物植株还是容易实现的。在这一过程中，单个转化的植物细胞能够最终长成一个完整的转化植物植株其每一个细胞都携带有克隆的DNA，并能够将这种克隆DNA通过开花和结实传递给下一代。 动物是无法从培养细胞再生出完整个体的，因此要获得转化的动物需要一个相当精巧的过程才能够实现。先将受精卵从输卵管中取出，通过显微注射向其中注入DNA，然后将转化后的细胞重新植入母体的生殖管道中。 β-半乳糖苷酶：是一系列将乳糖降解成为葡萄糖和半乳糖的酶中的一种。 通常由lacZ基因编码，该基因位于大肠杆菌染色体上。 一些大肠杆菌菌株携带有经过修饰的lacZ基因，该基因编码的蛋白相对于正常的lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶缺失了α-肽段的一部分。 这些突变体只能够在其俘获一个携带有细菌基因组缺失的lacZ基因的质粒时，比如说pUC8，才能够合成β-半乳糖苷酶。 判断β-半乳糖苷酶是否存在： 化学方法：乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖； 检测酶所催化的一个反应。 X-gal是乳糖相似物，该物质能够被β-半乳糖苷酶降解并生成深蓝色的产物。 如果X-gal(以及β-半乳糖苷酶的诱导物IPTG)和氨苄青霉素一起被加入到琼脂平板中： 不含重组体的菌落，即能够产生β-半乳糖苷酶的细胞就将被标记成蓝色； 含有重组体的菌落因为lacZ‘基因被破坏而无法合成β-半乳糖苷酶，将保持白色菌斑。 这一系统被称作乳糖筛选(Lac selection) 。 4.3 将噬菌体DNA引入细菌细胞 将一个用噬菌体载体构建的重组DNA分子引入细菌细胞，有两种不同的方法： 转染； 体外包装。 4.3.1 转染 这一过程与转化是相同的， 区别：使用的质粒载体换成了噬菌体。 像质粒那样， 将纯化的噬菌体DNA或重组噬菌体分子与感受态大肠杆菌细胞混合，并通过热休克将DNA引入到大肠杆菌细胞中。 4.3.2 体外包装 λDNA分子与成熟的λ噬菌体颗粒相比，对培养中的细菌细胞的侵染，没有那么高效。 因此，如果λ分子能够在试管中被包装到λ噬菌体的头尾结构中，将变得非常有用。 包装需要一定数量的由λ基因组编码的蛋白质，这些蛋白可以从缺陷性λ噬菌体侵染的菌株中高浓度制得。 所以，需要用到两个不同的体系。 1. 在单菌株体系中，缺陷性λ噬菌体在C0S位点有一个突变，因此内切酶不能识别C0S位点，不能切割λ连环体，造成缺陷性噬菌体无法完成复制。 但它能够直接合成包装所需的全部蛋白。 从细菌中收集蛋白并纯化，随后用于重组λDNA分子的体外包装。 2. 第二个体系中需要用到两个缺陷性λ噬菌体株。 两个噬菌体株都在编码噬菌体蛋白外壳的某一组分基因带有一个突变位点： 一个突变发生在D基因上； 另一个突变发生在E基因上。 由于突变基因造成的产物缺乏，导致完整的噬菌体衣壳结构无法形成，同时其他的噬菌体衣壳蛋白不断积累。 所以，任何一个噬菌体株都无法完成在大肠杆菌中的侵染循环。 如果使用两种细胞，一种被缺乏D基因的噬菌体侵染，另一种被缺乏E基因的噬菌体侵染，通过将两种细胞的裂解物混合在一起，就制得了体外包装的混合物。 现在的混合物包含了所有必需的成分，能够将重组λ分子包装到成熟的噬菌体颗粒中。 通过这两个体系，只需要把包装后的分子加入到细菌培养物中，就使得正常的λ侵染过程得以发生，进而可以把重组DNA分子引入到大肠杆菌细胞中。 4.3.3 噬菌体侵染的可视化形式 噬菌体侵染循环的最后一个阶段是细胞溶解。 如果加入噬菌体后，或在噬菌体DNA侵染发生后，被侵染细胞被立刻引入固体琼脂培养基，细胞溶解就能够以噬菌斑(plaque)的形象在菌苔上被观察到。 每个噬菌斑都是一个噬菌体溶解细胞后留下的空白区域，能够发生转移并最终消化邻近的细胞。 λ噬菌体和M13噬菌体都能够形成噬菌斑。 λ噬菌体：真正的噬菌斑，因为细胞溶解； M13：噬菌斑稍有不同，因为M13无法溶解宿主细胞，导致被侵染细胞生长速度下降。这种下降足以在菌苔