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核酸和蛋白质分析技术 第一节 核酸分析技术 讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、基因芯片 一、核 酸 电 泳 （一）DNA的凝胶电泳 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开. 琼脂糖凝胶电泳 材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、电泳装置. 过程：制胶→装胶→取出梳子→加样→电泳→溴化乙锭染色→紫外灯下观察→照相 注：溴化乙锭有致癌性，操作时带手套 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 （二）RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样. 但应注意： RNA分子对RNA酶非常敏感，因此必须用含RNA酶抑制剂的水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以减少RNA降解。 二 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理：DNA与DNA互补配对结合 （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 四、基因芯片技术（Gene Chip） 原理：芯片技术、核酸杂交与计算机技术结合 操作流程 1.探针的设计、合成与芯片的制作（商品化）； 2.靶基因样品的制备： 3.生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似 4.杂交信号的检测与结果的分析 激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机软件分析 第二节 蛋白质分析技术 一、Western Blot 二、ELISA 三、免疫荧光技术 四、免疫组织化学技术 一、 Western Blot 原理：抗原与特异性标记抗体结合 步骤： 1.电泳分离；2.转膜；3.杂交； 4.显影；5.分析。 ★ 蛋白质芯片 其制作原理类似于基因芯。 (三)串联重复序列多态性 重复单位较小，但重复的次数变化很大，形成串联重复序列多态性，主要有： 1.小卫星DNA多态性：复杂，个体差异极高。 2.微卫星DNA多态性：功能不太清楚. DNA多态性在法医、发病机制的研究、 疾病诊断、个体化用药等方面应用广泛。 Thanks！ 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/V ) DNA分子分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 聚丙烯凝胶电泳的银染结果 步骤： 1. 凝胶电泳分离样品DNA； 2.转膜：按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上； 3.杂交：将膜放入含标记探针DNA分子的液体中进行杂交。如果膜上含有与探针互补的序列，则样品DNA与探针DNA结合。 4.显影：放射性自显影或化学发光法显影 5.分析：与MARKER对比分析条带分子大小，用图象分析系统分析条带灰度值而获得分子的相对含量。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 杂交结果 1.芯片的制作：利用点样机等机械装置，在玻璃、硅片、尼龙膜等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条标记ＤＮＡ探针。由于ＤＮＡ探针有序地排列着，因此也被称为微阵列（Microarray）。这种排列着许多DNA探针的玻片称为基因芯片。 2.样品与探针杂交：在芯片上滴加荧光素标记的核酸样品，样品中的各种核酸片段就与相应的探针杂交。 3.显影：由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。 4.分析：经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。 （3）内含子和外显子 真核生物的结构基因是不连续的，编码序列被非 编码序列打断。 编码