DNA的粗提取与鉴定使用.pptVIP

专题5 DNA和蛋白质技术 课题1 DNA的粗提取与鉴定 课题目标 目标: 1本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质， 2理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。 课题重点： DNA的粗提取和鉴定方法。 基础知识 1、提取大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理、化学方法分离具有不同物理或化学性质的大分子。 3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？(原理) 1）、DNA的溶解性 ①DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。 3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？ 1）DNA的溶解性 ①DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。 2）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶只能使蛋白质水解 ②大多数蛋白质不能忍受60—80℃ 的高温而变性，但DNA在80 ℃ 以上才变性。 ③洗涤剂能瓦解细胞膜， 但对DNA没有影响。 3、DNA的鉴定 ①沸水浴下，DNA遇二苯胺被染成蓝色； 二苯胺鉴定DNA的化学原理： DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。 ②紫外灯照射法： 紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。 实验设计 （一）实验材料的选取 含有DNA的组织且DNA含量较多的组织。 比较下列材料哪些DNA含量高、适于提取 DNA？为什么？ 旁栏问题 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞：蒸馏水 搅拌 旁栏问题 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞：蒸馏水 搅拌 2、植物细胞：洗涤剂和食盐 搅拌和研磨 若探究提取效果，可设置对照实验。 旁栏问题 3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 实验设计 （三）去除滤液中的杂质 方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同； 实验设计 （三）去除滤液中的杂质 方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同； 方案二： 加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶） 方案三： 60—75℃恒温水浴保温10—15min 旁栏问题 6．方案二与方案三的原理有什么不同？ 实验设计 （四）DNA的析出与鉴定： 95%的冷酒精 静置2—3min，出现白色丝状物 玻璃棒卷起 加入2mol/L氯化钠溶解， 加入4mL二苯胺试剂，摇匀，沸水浴5min，观察颜色变化。 （注意设置空白对照） 使用冷的乙醇溶液具哪些优点？ 一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； 二、降低分子运动，易于形成沉淀析出； 三、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 P56操作提示 1、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血液凝固； 2、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量气泡； 加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂。 3、二苯胺试剂现配现用。 结果分析与评价 （一）是否提取出了DNA 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。 结果分析与评价 （二）分析DNA中的杂质 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 （三）不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。 练习 提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 练习 提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取