引物設计专题.docxVIP

引物设计原则：（1）引物的长度一般为15~30bp，常用的是18~27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74°，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。（2）引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。（3）引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。（4）引物序列的GC含量一般为40%~60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72°左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。（6）△G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。（8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则① 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 ② 产物不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的③ 引物长度一般在B15~30/B碱基之间。寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为gt;38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 ④ G+C含量在40%~60%之间。G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G +C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。⑤ 碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3’端不应超过3个连续的G或C，容易使引物在G+C富集序列区引起错配。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引起引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3个碱基。⑦ 两条引物之间不能有连续4个碱基的互补。两条引物之间不应有互补性，尤应避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 ⑧ 引物5端可以修饰 引物的5’端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、同位素等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。⑨ 引物3’端不可修饰。引物的延伸是从3’端开始的，不能进行任何修饰。3’端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配。⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率以上是一些通用性规则，一般情况下都应该遵守。但也需根据实际情况设计合理的引物