11基因工程基本技术.ppt

原理： 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性 与复性的差异而达到分离目的.当PH≥12.6时，染色体DNA与质粒 DNA的变性.当PH＝7时，质粒DNA复性，溶解在溶液中.而染色体DNA不能复性，形成缠 连的网状结构，离心后沉淀下来. 具体操作步骤 1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2mlLB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃250转／分钟振荡培养过夜(约12-14h)。 2．取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g lmin，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3．将细菌沉淀重悬于100ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4．加200ul新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。 5．加入150ul预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K使SDS—蛋白复合物沉淀。 6．加人450ul的苯酚／氯仿／异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。 7．小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2.5min，4℃离心12000g 15min。 8．1ml预冷的70％乙醇