蛋白质组学及其在肾脏病研究中的应用.ppt

 蛋白质组学及其在肾脏病研究中的应用 主要内容 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在肾脏病研究中的应用 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。 在空间和时间上动态变化着的整体。 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组学研究的内容 ①结构蛋白质组学 主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、种类分析、数量确定等； 蛋白质结构测定主要是应用X-光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法； ②功能蛋白质组学 研究蛋白质的功能，确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，蛋白质-蛋白质的相互作用等。现在蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在不同种类、不同时间和条件下的动态本质。 在功能蛋白质组学或蛋白质相互作用方面，较常用的有酵母双杂交系统（包括单杂交、三杂交、反向杂交的系统）、免疫共沉淀技术、表面等离子技术、荧光能量转移技术等。 二、蛋白质组学的产生与发展 2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。 2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月召开了中国蛋白质组学首届学术大会，2007年8月在广州召开了第五届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。 蛋白质组学的前沿 蛋白质组学的前沿大致分为3大方向： ①针对已完成基因组或转录组研究的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组（或蛋白质表达谱）及其蛋白质连锁群，即组成性蛋白质组学研究； ②以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学研究； ③蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。 一、蛋白质组表达模式的 研究方法 蛋白质组表达模式（expression profile）： 研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。 研究流程 （一）蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。 样品预分级的主要方法 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等 样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。 组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。 激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。 （二）蛋白质组研究中的样品分离 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 原 理 第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)。 1975年首先由O’Farrell等创立。 特 点 可分离10～100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 第一向IEF电泳 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 第二向SDS电泳 垂