质粒DNA提取鉴定2011.pptVIP

质粒DNA提取、鉴定 质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子（补充：部分质粒为RNA） 。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。 有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。 质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。 质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。 ? 质粒分类： 严紧型（每个细胞1－5个质粒）， 当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次； 松弛型（每个细胞10－200个质粒）。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。 一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。 质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 pBR322质粒(4363bp) : 主要包括： ①限制性内切酶位点（插入外源基因）； ②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。 ③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。 M13噬菌体： M13mp系列 pUC系列 pUC质粒:含E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。 Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段. 单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。 本实验： 大肠杆菌＋pEC-ct质粒， pEC-ct质粒：8.0kb (6.8kb) 有Hind Ⅲ, BamH Ⅰ酶切点，可切出CD基因（1.2kb） 本实验包括： 1. 细菌培养和质粒扩增 2. 菌体收集 3. 菌体裂解、质粒DNA提取、纯化 4. 鉴定 [操作] 细菌的培养 接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37 ℃培养24 h 单克隆培养： 挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp 50μg/ml) 4-6 h。 菌液0.2 ml＋10 ml LB培养基（含Amp 50μg/ml) 37 ℃培养过夜。 4. 扩大培养：培养液3 ml,接种于60 mL 的LB培养液（含Amp 50μg/ml),振摇200 rpm， 37 ℃(4-6 h), 使A580＝0.4-0.6。 5. 加氯霉素：加氯霉素，终浓度40 μg/ml，继续培养15-17h. 1. 取6 个1.5 ml Eppendorf 管，分别加细菌培养液1.4 ml ↓ 9000rpm 2-3min ↓↘弃上清 2. 600 μl STE液依次溶解各管沉淀，合并一管 再用200 μl STE液清洗各管，清洗液合并上管（收集菌体 ） ↓ 9000rpm 2-3min ,弃上清 （保留菌体） 3。沉淀悬于200 ul溶液I，混匀 ↓ 放置 5 min 4。加入400 ul溶液II，颠倒混匀数十次（20～30次） 0.2N NaOH-1%SDS ↓放置5 min 5。加入300 ul溶液III，充分混匀（温和操作） ↓ 10 min 12000rpm 3min ↓↘弃沉淀 6。将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540 ul )，倒转混匀 ↓ 室温5 min 离心12000rpm 10 min ↓↘弃上清 沉淀干燥，室温 5 min ↓ 7。加TE 500ul溶解沉淀 8。加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀