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第三章、转基因微生物与生物医药 第三章、转基因微生物与生物医药 （微生物反应器） 一、 基因工程菌的制备和表达 （一） 基因工程菌的制备 1 目的基因的获得和表达载体构建 2 菌种的选择 基因工程的宿主菌多种多样： （1）原核细胞 大肠杆菌：方便，采用最多。但缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统。 枯草芽孢杆菌 链霉菌 （2）真核细胞 酵母：应用广泛。可对真核生物蛋白质的修饰加工。 丝状真菌 3 菌种的转化和鉴定 （二） 基因工程菌的培养 1、基因工程菌的培养设备 发酵罐组成：发酵罐体、搅拌器、温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。（图） 发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件；培养过程不得污染；保证纯菌培养；培养及消毒过程不能干扰细菌代谢等。 2、基因工程菌的培养方式 （1）补料分批培养 将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。 （2）连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 （3）透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。 （4）固定化培养 以多孔陶瓷为载体吸附法固定重组大肠杆菌。 （三） 基因工程菌的表达 1、外源基因在大肠杆菌中的表达诱导（例如启动子是Lac） 筛选到的阳性重组子菌株 ↓ 用LB培养基在37℃培养过夜 ↓ 以1%的比例接种至100ml的表达用培养基中 ↓ 37℃培养至OD≈0.7-0.8 ↓ 加入 IPTG (异丙基- β -D- 硫代半乳糖苷) （终浓度0.5nmol/L） ↓ 37℃，振摇培养一段时间 ↓ 4℃，低温离心，收集菌体备用2、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 （1） 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达 　 包涵体：大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。 优点：容易表达，可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解。通过超声波破碎，离心等能比较容易地对其进行初级纯化。 缺点：纯化过程中需变性／复性，过程繁杂。经变性／复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，相对分子质量较大的蛋白质基本上不能进行正确重叠。 （2） 以分泌型蛋白表达外源药物基因 　 通常需用位于细菌某蛋白质Ｎ端的一段氨基酸序列（称为信号肽）帮助蛋白通过细胞膜。或将大肠杆菌（革兰氏阴性菌）改造为分泌型细菌。 优点：目的蛋白易于分离；目的蛋白末端完整 缺点：外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。且容易被宿主菌中蛋白水解酶降解。　　 （3） 以融合蛋白形式表达外源药物基因 　 融合表达：是指将目的药物基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，使二者以融合蛋白形式表达。 用于融合的表达标签蛋白和多肽： β-半乳糖苷酶（LacZ）和谷胱甘肽转移酶(GST)等。 优点：* 目的蛋白稳定性高：保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解。 * 目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白的纯化过程。 缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获的目的蛋白。 （四）影响基因工程菌发酵和外源基因表达的因素 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别： （1）生物材料方面：基因工程菌带外源基因 （2）生产目的方面：使外源基因高效表达 微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的外源基因表达产物。 （3）生长速率方面：较慢 1、培养基的影响 要求：提高工程菌的生长速率；保持工程菌的稳定性；使外源基因高效表达。 常用碳源：有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和、氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 其他：另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。 对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。如无机磷 例如：在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。 不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。 葡萄糖对l