拼接组建真核载体的基因变化.docVIP

拼接组建真核载体的基因变化 ; 引言ADAM10为同时具有解整合素和金属蛋白酶两种结构域的Ⅰ型跨膜蛋白,是ADAMs(ADisintegrinandMetalloprotease)家族的重要成员,广泛存在于各种组织细胞中,主要负责水解脱落多种跨膜蛋白的胞外结构域,其水解底物包括Ⅳ类胶原蛋白、EGF、betacellulin、TNF-α、Notch、CD23、CD89、CD44、CAM1、E-cadherin和N-Cadherin,具有α分泌酶活性参与APP的水解代谢等,在众多生理病理活动发挥重要作用[1-4]。本文拼接构建ADAM10真核表达载体,为进一步研究ADAM10的生物学功能提供材料。在构建过程中,观察到罕见的目的基因在大肠杆菌DH5α为宿主菌时插入增加512bp的突变现象,后通过更换克隆宿主菌株的办法予以克服,报告如下。; 1材料与方法; 1.1材料; 1.1.1实验材料人ADAM10基因全长2247bp(含终止密码TAA),位于序列910bp处有唯一一个EcoRⅠ酶切位点,以该点为界,可将全长分为上下游两个部分,先期分别克隆了上下段序列的载体由作者实验室保存,其中下段载体中ADAM10序列C末端已引入XhoⅠ酶切位点。通过PCR引入HindⅢ和EcoRⅠ位点获得用于拼接ADAM10全长的ADAM10上段基因序列,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切含目的基因的克隆载体获得ADAM10下段基因序列(见图1)。大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3),pcDNA3.1真核表达载体由作者实验室保存。; 1.1.2试剂引物合成与测序为上海英骏生物技术公司,主要引物为P1:5’-TAGAAGCTTGCCACCATGGTGTTGC(含HindⅢ位点),P2:5’-CTGCTCAGAATTCAATTCCAG(含EcoRI位点),P3:5’-TTAGCGTCTCATGTGTCC-3’,其中P1/P2用于扩增ADAM10上片段,P1/P3可扩增ADAM10基因全长。TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ和XhoⅠ等为大连宝生物公司产品。DNA凝胶回收试剂盒为AXYGEN(爱思进)公司产品。; 1.1.3仪器图1pcDNA-ADAM10真核表达载体构建图Fig.1ConstructionofpcDNA-ADAM10recombinantplasmid美国PE-2400PCR扩增仪;上海培清JS-380A凝胶成像系统;北京六一DYY-Ⅲ2型电泳仪。; 1.1.4培养基LB培养基,LB固体培养基,按需要加入氨苄青霉素(100mg/L)。; 1.2方法; 1.2.1ADAM10基因上半段与pcDNA3.1的连接以ADAM10上半段克隆载体为模版,用P1/P2引物扩增出ADAM10上半段序列,PCR产物经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,回收纯化后与同样双酶切的pcDNA3.1表达载体相连接,常规CaCl2法转化感受态DH5α,涂含氨苄青霉素的LB平板,通过PCR、酶切和测序筛选鉴定阳性克隆,命名pcDNA-AD-AM10(up)。; 1.2.2ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化DH5α用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切含有ADAM10基因下半段的克隆载体,回收纯化后与同样双酶切回收的pcDNA-ADAM10(up)重组载体片段相连,CaCl2法转化感受态DH5α,提取单菌落质粒,用EcoRI和XhoⅠ进行双酶切,用PCR以P1/P3引物扩增ADAM10基因全长,全长PCR产物再用EcoRⅠ单酶切,最后测序等方法筛选鉴定阳性克隆,命名pcDNA-AD-AM10(up+down)。; 1.2.3ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并转化BL21(DE3)步骤同1.2.2,仅将感受态菌由DH5α换为BL21(DE3)。鉴定完全正确的连有ADAM10全长基因的重组质粒命名pcD-NA-ADAM10。; 1.2.4pcDNA-ADAM10全长重组质粒转化DH5α后的稳定性将在BL21(DE3)中构建正确的pcDNA-ADAM10再转化DH5α,提取转化菌落的质粒,然后用PCR和酶切鉴定,步骤同上。; 2结果与分析; 2.1ADAM10基因上半段与pcDNA3.1的连接ADAM10基因上段与pcDNA3.1连接后转化DH5α,阳性克隆经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切可得到大小约910bp和5.4kb的预期带,PCR扩增ADAM10基因上半段也可以得到约910bp的预期带(见图2),测序结果显示ADAM10基因上段与pcD-NA3.1的连接完全正确,无任何突变。; 2.2ADAM10基因下半段与pcDNA-ADAM10(up)重组质粒连接并