qPCR技术答题.ppt

2.qPCR原理和方法 —定量原理 * * 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * Fluores cence 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * Ct值的定义： CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)， CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 CT值由阈值确定 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * 阈值(threshold) 缺省值设定为基线（baseline，即本底信号）范围(3-15个循环)内荧光信号强度标准偏差的10倍。? 阀值由基线确定 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * 理想的PCR反应: Xn＝X0 * 2n Xn ：第n次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量 n ：扩增循环数 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * 非理想的PCR反应: Xn＝X0 * (1+En)n Xn：第n次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量 n： 扩增循环数 En: 扩增效率 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M ---------------- (1) XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0(1+Ex)*Ct----------------(2) 整理方程式(2)得: lg X0= -Ct×lg(1+Ex) + lg M---------- (3) 扩增产物的对数与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。 2.qPCR原理和方法—定量原理 * * 荧光强度---循环数曲线 初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线 104 103 106 105 102 10 浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 2.qPCR原理和方法—定量原理 绝对定量 目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。 相对定量 不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的PCR产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。 * * 绝对定量 * * 敏感性高: 检测低拷贝数样品; 区分小差异样品 大范围拷贝数样品 同时检测: 100 — 1010 省时有效 临床检测， 转基因检测 环境监测等 标准曲线法相对定量举例 * * 标准曲线法相对定量举例 * * 设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因 对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标基因拷贝 双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线； 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理， 标本间靶基因的表达水平分析 2 -ΔΔc(t) 法 标本内靶基因与内标基因Ct值比较： ΔC(t) =C(t)m- C(t)n 标本间ΔC(t) 比较： ΔΔc(t)＝ ΔC(t)1-ΔC(t) 2 -ΔΔc(t) 计算 标准曲线法相对定量举例 * * 标准曲线法相对定量举例 * * 3. qPCR的应用1，定量分析2，定性分析 * * 3.qPCR的应用—定量分析 绝对定量分析：DNA 或 RNA 的绝对定量分析 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。 相对定量分析：基因表达差异分析 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达， 特定基因在不同时相的表达差异 cDNA 芯片或差显结果的确证 * * 3.qPCR的应用—定性分析 定性分析： 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增； 利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测、 甲基化检测等。 随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用 * * 谢谢大家！ * * 一般包括：裂解液RL 去蛋白液RW1 漂洗液RW 此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。