细胞实验教案1讲解.doc

细胞生物学实验教案 实验一细胞核与线粒体的分级分离、原理???细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。??、细胞核的分离提取??(一)操作步骤??1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。??2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。??3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片，做好标记，自然干燥。??4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。??5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片，自然干燥。??6．将、、涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。??(二)结果??分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。??、高速离心分离提取线粒体??(一)操作步骤??1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。??2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。??3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记、涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。??(二)结果??油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。实验细胞膜的通透性观 2. 观察并掌握相对分子量、脂溶性大小、电解质和非电解质对细胞膜通透性的影响。 二、实验原理 细胞膜在不断变化的环境中必须保持自身的稳定状态才有生存。细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻止另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。 水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。 三、实验用品 1. 实验材料 血液（兔血或鸡血，含适量肝素） 2. 仪器 50mL烧杯、10ml试管、试管架、 制备10%红细胞悬液：把一份动物血液和10份0.17M氯化钠溶液加入到50ml烧杯中即为稀释的红细胞悬液（不透明的红色液体）。 溶血实验取0.3ml动物红细胞悬液加入到3ml蒸馏水的试管中，晃动试管使之混合均匀，溶液由不透明的红色变为透明的红色，记录发生溶血（可以通过试管壁看清实验指导上的字为标准）的时间。 3ml不同的等渗溶液，做好标记后，分别加入0.3ml红细胞悬液，轻轻振荡，仔细观察是否发生溶血并记录发生溶血的时间。 （是否发生