第6章分子生物学方法(下)详解.ppt

半抗原：能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合,但不能单独刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞的物质,称为半抗原。 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质—— Digoxigenin （DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是DIG胜于生物素(Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。 技术特点： 与放射性标记和检测技术相比较，DIG 系统具有一下多个优势： ?高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度向媲美 ?曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程 ?安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染 ?探针可重复使用，最少可以稳定储存一年 ?可轻松进行探针拨离和重探 ?凭借多年的经验和众多使用者的反馈意见，提供全面的应用指南 应用领域： 地高辛系统能够安全高效地标记DNA, RNA或是寡聚核苷酸探针，这些探针可以被广泛地应用在 ?Southern blotting, dot blotting ?Northern blotting ?Array ?Colony hybridization ?In situ hybridization ?ELISA 抗生物素蛋白avidin存在于卵白中的碱性糖蛋白，因它贪婪地（avidly）与生物素结合，故有此名（avidin）。给动物以生的卵白则产生生物素缺乏症，因为生物素蛋白与生物素结合，使之失活。分子量为68300，含4个亚单位。在体外（试管中）对含生物素的酶具有特异的抑制作用。 * Western Blot 间接法基本原理：首先利用SDS对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。 * Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 * Western Blot 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。 * 1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation) 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。 一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 样品提取以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100℃充分变性