引物设计实例分析(多图).docVIP

引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值 （melting temperature）G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框 1. 引物的长度 一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度 2. 产物的长度 扩增片段长度为100~600碱基对。 3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度， 尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。 如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。 Tm=2（A+T）+4（C+G） 4. 引物的GC含量 有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物自身 引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 任务 用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第一步：扩增GFP基本序列 第二步：GC比值；Tm值 第三步：酶切位点 第四步：阅读框第五步? 保护序列 Primer1: 5??? GCGGggatccTATG