DNA的质量监测通常有两个方法讲义.docVIP

DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。 限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。 5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。/enzyme/login.php 全基因组甲基化测序：DNA 甲基化是指在 DNA 甲基化转移酶的作用下，在基因组 CpG 二核苷酸的胞嘧啶5\碳位共价键结合一个甲基基团。DNA 甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。甲基化是基因表达的主要调控方式之一，研究染色体DNA甲基化情况是了解基因调控的重要手段。对已经有参考基因组的物种的基因组DNA用标准亚硫酸氢盐（Bisulfite）处理后，未甲基化的胞嘧啶C会脱氨基形成尿嘧啶U，经PCR扩增，U替换为胸腺嘧啶T，而发生甲基化的胞嘧啶C保持不变。将处理组与参考基因组序列进行比对，可发现甲基化位点并对甲基化情况进行定量分析的方法叫做全基因组甲基化测序。 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5-CG-3序列。大多数脊椎动物 HYPERLINK /view/3851989.htm \t /_blank 基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， HYPERLINK /view/1741082.htm \t /_blank 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起 HYPERLINK /view/8563.htm \t /_blank 基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分