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石蜡包埋人体组织STR检验的探讨 【摘要l目的探讨普通甲醛对人体组织dna的影响及提高str检出率的手段。方法取少量石蜡包埋组织，65℃水浴脱蜡， chelex一100法提取dna，pcr扩增，循环次数分别为28次和28+6次，扩增产物经310型测序检测。结果普通甲醛固定5 d以内的 组织基本上可检出amel及15个str基因座。固定时间延长，检出率下降；pcr循环次数增加，灵敏度增加，但有错误分型的情况。 结论普通甲醛固定时问长短直接影响pcr—str的检验。减少模板量有利于pcr反应成功，pcr次数为28+6时，灵敏度增加，但 应谨慎判读结果，以免错误分型。 【关键词】石蜡包埋组织；dna提取；str 【中图分类号】d919．2 【文献标识码】b 【文章编号】1007—9297(20xx)01—0050—03 在某些民事案件中。成功对石蜡包埋组织进行 pcr—str分型来判断其归属问题。对案件的解决起到 重要作用。目前国内医院及科研机构大多使用普通 10％甲醛固定人体组织。普通10％甲醛固定石蜡包埋 的组织中dna降解相对严重，提取高质量的dna并 进行pcr—str分型较为困难。实践中人体组织固定 时间长短不一，但以1周左右多见。本文的目的是探 索普通10％甲醛固定时间对pcr—str分型的影响以 及提高检出率的适当方法。 材料与方法 一 、材料 石蜡包埋人体组织均取自本所病理室。5个无关 个体的心、肾组织用1o％普通甲醛固定5 d、8 d、12 d 和15 d以上时．剪取组织边缘甲醛完全浸润处。石蜡 包埋，常规切片he染色，显微镜下观察确保组织结构 清晰，无自溶、坏死和大片出血后，作为本研究材料使 用。 二、方法 1．预处理。切取8 ixm厚的石蜡包埋组织，尽量剔 除石蜡部分，放入0．5 ml离心管中；或挖取小米粒大 的石蜡包埋组织，放入0．5 ml离心管中。加入500 ddw，65c【=保温10min脱蜡，弃除液体。【 】 2．dna的提取。向每个离心管中加入150 ixl的 5％chelex一100和8 l pk (20mg／m1)，56 c【=保温过夜， 次日再加4 lpk(20mg／m1)，再消化4h，振荡后，100cc 8rain，13000 rpm／min离心3rain，4 oc备用。 3．pcr扩增。采用identifiler荧光复合扩增。采用 10 l反应体系，热循环条件：95 c【=预变性l1 rain；94 oc 1rain，59 oc lmin，72℃ lmin，循环次数分别为28 次，28+6次(循环28次后，每反应管加0．3 ixl ampli taq gold dna聚合酶，再循环6次)；[2】最后60℃延伸 45raino 4．上样检测。取1．5 l dna pcr产物与l2 l甲 酰胺(formamide)、0．4 ixl内标(liz)混合后，经过abi 310 dna自动测序仪电泳荧光检测，使用genescan(3． 1．2)和genotyper软件分析得出基因分型结果。 结果 1．经普通甲醛固定5 d、石蜡包埋的心和肾组织基 本上能检出完整的str等位基因型。而随着固定时间 的延长，能检出的str基因座数目逐渐减少．出现了 大片段等位基因缺失、等位基因扩增不平衡的现象 (见图1。2)。本次试验中观测到最短固定时间为8 d 的组织，因大片段等位基因缺失而造成假纯合子的错 误分型(见图3)。而固定时间超过15 d时。则最多只 能检出性别及个别小片段str基因型，常伴有分型错 误。 2．当pcr循环数从28次增加到28+6次(先循环 28次再加酶循环6次)时，可以检出以前信号弱、无法 判读的峰，提高了检出率(见图4)。循环次数的增加， dna检测灵敏度有所提高。但随着固定时间的延长， dna降解严重，增加扩增循环次数．易引起部分str 基因座的分型错误．如图5中d3s1358基因座出现的 pull—up峰。sm k,t．．．．-28-~ ．fs4 t blue ’4-ed-xln-28+6 94mple1●?-284．6．fs4 ’gre4,n 14-113d-xks-28．i．6 s4~npbl●?q}●+‘ 1 — i~ xir,-2sl+6 图4 提取普通甲醛固定8天心肌dna，pcr循环数为28次(左图)及28+6次(右图)的检测结果 8mlnpk,9,-．． ’摹i抽’2 yeller 9-xin-t5d sm iple~ ,．．2e+6．fsa i3自h 9．-xi~ l5d跏 smtple~’ ’●‘一fn i 5 v●l● _ 9-xks-i5d；~ ’6 sin k9= 2 ．6．fl蚺l善r．d 9．-xi~ lsd柳6 图5 提取普通甲醛固定15天心肌dna