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应用AFLP分子标记鉴定苹果品种 祝军　王涛　赵玉军　张文　李光晨 　　提　要　在建立苹果品种AFLP分析体系的基础上，从68对引物中筛选出了4对多态 性高、分辨能力强的引物（即P32M46、P44M53、P59M41和P79M61）。分析了P32M46引物绘制 的我国25个苹果重要品种的AFLP指纹图谱的遗传多样性，确定了各供试品种的差异带，区分 了供试的25个苹果品种。对AFLP分析的关键步骤进行了讨论，并对生产上应用AFLP技术检测 苹果品种真实性和纯度作了展望。　　关键词　AFLP；DNA指纹；苹果；品种；鉴定 Identification of Apple Varieties with AFLP Molecular Markers Zhu Jun，Wang Tao，Zhao Yujun，Zhang Wen，and Li Guangchen（College of Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100094） 　　Abstract　Four pairs of primers（i.e.P32M46，P44M5 3，P59M41 and P79M61）with high polymorphism and powerful distinctiveness have b een selected from 68 pairs of primer after constructing the AFLP analysis system in apple varieties.Genetic diversity of P32M46 AFLP fingerprinting of 25 import ant apple varieties in China was analyzed，difference bands for each varieties w ere determined，and all apple varieties tested were identified based on the P32M 46 AFLP fingerprinting.Key points and application for testing trueness and purit y of apple varieties of AFLP techniques were discussed.　　Key words　AFLP；DNA fingerprinting；Apple（Malus domestica Borkh.）；Variety；Identification 　　苹果品种鉴定是种质资源研究的基础和苗木市场管理的技术手段。传统的苹果品种鉴定方法 主要有形态特征法、花粉显微电镜扫描法和同工酶法〔1，2〕。近年来，DNA分子标 记技术的出现为在DNA分子水平上鉴定苹果品种提供了强有力的工具〔3〕。应用RAPD （Random Amplified Polymorphic DNA）分子标记技术鉴定苹果品种国内外已有报道〔 4，5〕，而应用AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）技术鉴定苹果品种的 研究尚未见报道。　　AFLP分析的基本原理是选择性扩增基因组DNA酶切片段。由于不同基因组DNA的酶切位点存在 差异，因而产生了扩增片段长度的多态性〔6〕。本试验于1996～1997年在中国农业 大学“农业生物技术国家重点实验室”和中国农业科学院品种资源研究所“农业部种质资源 生物技术重点实验室”进行，应用AFLP技术绘制了我国苹果生产中25个重要品种的DNA指纹 图谱，并根据该DNA指纹图谱对供试材料进行了遗传分析和鉴定。 1　材料与方法 1.1　材料　　供试苹果（Malus domestica Borkh.）品种及其亲本见表1。试材品种中 ，柱型苹果品种取自中国农业大学实验果园；其它品种取自中国农科院果树所“苹果国家种 质资源圃”，其中包括主栽品种，核心种质品种，不同生长习性、亲缘关系和突变品种等几 种类型。1.2　方法1.2.1　模板DNA的制备　于春季取健康正常幼叶放入冰壶，带 回实验室后用HCl 0.1　mol/L溶液洗涤，无菌水冲洗。低温干燥 后，按Doyle等〔7〕报道的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法，从试材鲜叶中提取基 因组DNA。经检测后，将DNA稀释至200　ng/μL，备用。1.2.2　酶切　每个反应总体积为25　μL，其中包括： DNA 250　ng，PstI和MseI（BioLab）各 2.5　U，BSA 1 .2　μg，0.5×RL Buffer。37℃保温6　h。1.2.3　连接　酶切后，每个D