2-疏水层 (HIC)课件.ppt

疏 水 层 析 （HIC） 一 实验原理疏水层析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) 是利用被分离 样品中不同生物分子表面的疏水性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。疏 水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体，如苯基琼 脂糖（Phenyl Sepharose）, 辛基(Octyl),丁基(butyl) 琼脂糖等。对于不同的蛋白质和多肽而言，其分子表面一般有着不同的疏水和亲水结构 区域，当将这些生物样品加入到含有高盐（高离子）浓度缓冲液的HIC 柱中时， 由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用，降低了样品分子的溶剂化作用，从而 增加暴露了样品分子表面的疏水区，这样就促使样品分子表面疏水基团与HIC 柱 上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到HIC柱上。因此疏水层析亦称疏水相 互作用层析。样品吸附在 HIC柱上的强弱程度，取决于样品本身的疏水性质和样 品环境中盐离子的强度。一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度，疏水性弱的则需要较高的盐浓度 [如1.0 mol/L (NH4)2SO4]。吸附在HIC柱上的生物分子，可以采用降低洗脱液中 盐浓度的方法，使其从柱上洗脱下来，洗脱方法可以是梯度也可以是阶段洗脱的 方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性强与弱从先到后，从而达到分 离的目的。 二 实验目的与要求通过苯基琼脂糖疏水层析柱，采用阶段洗脱的方 式分离——血红蛋白，以此了解疏水层析的原理、方法 和实际的应用。 三 实验仪器与器材 3-1、实验仪器 （1）、层析工作站装置 （2）、笔记本电脑 （3）、紫外检测仪（4）、磁力搅拌器 （5）、恒流泵 （6）、天 平 （7）、混合器 3-2、实验器材 （1）、 可调取液器 （2）、 量 筒（3）、 烧 杯（4）、 层析柱（5）、 吸 管（6）、 吸管架 （7）、 滴 管 （8）、 剪 刀（9）、 镊 子（10）、 玻 棒 （11）、 骨 勺（12）、 洗耳球（13）、 称量纸（14）、 吸水纸（15）、 保膜鲜（16）、 标签纸 （17）、 记号笔 四 试剂与配制 4-1、实验试剂 （1）、BSA （2）、苯基琼脂糖（3）、磷酸氢二钠（4）、磷酸二氢钠（5）、硫 酸 铵（6）、无水 乙醇 4-2、试剂配制 （1）、Buffer A（0.02 mol/L pH7.2磷酸缓冲液含1.0 mol/L硫酸氨）的配制：分别称取Na2HPO4___ 克， NaH2PO4___克和[NH4 ]2SO4___ 克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。 （2）、Buffer B（0.02 mol/L pH7.2 磷酸缓冲液）的配制：分别称取Na2HPO4 ___ 克和NaH2PO4___克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。 （3）、乙醇（20%）溶液：取20.0 ml无水乙醇，然后加80.0 ml蒸馏水，混匀即可。 （4）、样品（10mg/ml）溶液：称取10.0 mg BSA，加1.0 ml Buffer A溶液溶解[如有不溶物质，需在8000rpm离心5分钟，取上清作为上柱样品，本品易溶]。 五 实验步骤 5-1、苯基琼脂糖[Phenyl Sepharose] 凝胶的处理商品化的Phenyl Sepharose凝胶颗粒保存在20%的乙醇溶液中， 使用时取适量体积的凝胶在砂芯漏斗中用大于10倍凝胶体积的蒸馏 水充分洗涤，然后将洗净的凝胶转移到含有Buffer A的烧杯中。 5-2、装柱 （1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约1.0 cm高）洗脱液。 （2）、将烧杯中已处理好的Phenyl Sepharose凝胶，加适量的Buffer A，搅成悬浮状，然后沿柱内壁细心的加至一定刻度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。（3）、待树脂在柱子底部有明显沉积（10分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的平衡液，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度为3.0厘米为止。 （4）、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。 （5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。 （6）、在装柱的同时应将其他仪器设备接通电源，并按实验要求进行调试。 5-3、平衡用5倍床体积的B