中国汉族人群2型糖尿病30个候选基因相关性分析.pptVIP

中国汉族人群2型糖尿病与KCNJ11基因相关性分析 研究生：王颖 导师“：孙子林教授 实验摘要 方法 对KCNJ11基因进行单核苷酸多态性(SNP)的发现、基因分型，并进行单倍型构建。对群体资料的SNP和单倍型数据进行病例一对照研究，并在77个trio家系中进行传递不平衡检验(TDT)。 应用报告基因法对1个阳性SNP位点rs5210的基因表达调控作用进行分析。 结果 KCNJ11基因的几个SNP位点与中国汉族人群2型糖尿病相关 其中rs5219的等位基因频率，rs5210、rs2285676和rs5219的基因型频率，以及由rs5219和rs5215构成的单倍型GA的频率，在病例组和对照组间差异具有显著性(P0．05)，单倍型GA的TDT检验也具有统计学差异(P0．05)。 报告基因分析显示rs5210两个等位基因的基因表达调控作用差异具有显著性(P0．05)。 结论 KCNJ11 基因是中国汉族人群2型糖尿病易感基因之一。 KCNJ11基因 Kir6.2蛋白 TGF7L2 材料和方法 群体资料采集： 确诊为2型糖尿病的中国汉族患者中随机抽取502例 其中男性252例，女性250例； 年龄主要集中于40～65岁(61％)； 体重指数24.8±4.0； 2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准 执行。 对照组取自与病例组相同地区的健康成人 从35岁以上且无2型糖尿病家族史的中国汉族健康成人中随机选取男性267名，女性234名；年龄主要集中于40～65岁(70％)；体重指数23.8±3.3。 两组的年龄、体重指数等差异无显著性。 每名受试者采集血样10ml 基因组DNA提取 分离白细胞，应用盐析法提取基因组DNA 发现SNP 从病例和对照组中随机抽取48个样本，每组24个，对其启动子区(转录起始点上游2kb)、外显子区及邻近内含子区、下游区(外显子下游1 kb)进行PCR扩增， 引物通过在线软件Primer3设计， PCR扩增体系如下：Mg离子1．5 mmol／mL，dNTP 0．2 mmol／mL，引物0．2mmol／mL，HotstarTaq酶(0．03 U／mL) ，基因组DNA 0．3ng／mL ，10 X bufer 1．5 ml，加去离子水至15mL 。 反应体系经94℃变性15 min进行热启动，恢复Hotstar Taq酶的活性，94℃变性30 S，57℃退火40 S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。 对PCR产物进行测序， 通过对测序结果的判读来发现SNP位点。 基因分型 基因分型采取PCR产物直接测序和扩增受阻突变体系相结合的方法进行SNP基因分型。 为防止假阳性现象，先对48个样本分别应用扩增受阻突变体系和PCR产物直接测序法进行检测，若二者结果相符合，则应用扩增受阻突变体系进行基因分型， 对于不能用扩增受阻突变体系进行基因分型的位点，则采用PCR产物直接测序法进行分型 单倍型构建 采用等位特异PCR法和软件phase 2．0 计算相结合的方法进行单倍型构建。 结果 KCNJ11基因的几个SNP位点与中国汉族人群2型糖尿病相关 其中rs5219的等位基因频率，rs5210、rs2285676和rs5219的基因型频率，以及由rs5219和rs5215构成的单倍型GA的频率，在病例组和对照组间差异具有显著性(P0．05)，单倍型GA的TDT检验也具有统计学差异(P0．05)。 报告基因分析显示rs5210两个等位基因的基因表达调控作用差异具有显著性(P0．05)。 统计学处理 以Hardy-Weinberg平衡法检验基因频率的代表性。应用SPSS 11．0统计软件对每一SNP位点等位基因频率、基因型频率在病例组和对照组间的差异进行双侧 检验，其中，每个SNP位点存在3种基因型形式，进行7种组合的病例对照分析。 对基因型对单倍型频率在对照组和病例组间的差异进行双侧 检验。应用TDT—STDT软件进行传递不平衡检验。 结 果 KCNJ11基因内的SNP位点与中国汉族人群2型糖尿病相关性 SNP的发现：对随机抽取的48个中国汉族受试者的KCNJ11基因的启动子、外显子和3’下游区进行PCR扩增和测序，共发现6个频率高于15％ 的SNP位点，这些位点的NCBI SNP数据库收录号分别为rs5219、 rs5218、 rs5215、 rs5213、 rs5210 和rs2285676，其中rs5219、rs5218、rs5215位于外显子编码区(rs5219和rs5215引起氨基酸编码改变)，rs5213、rs5210位于外显子3’非翻译区，rs2285676位于下游区 对每个SNP位点存在的3种基因型形式，进行7种组合的病例对照分析，结果显示rs5210的基因型