2613-欧洲药典.doc

2.6.13.非无菌药品的微生物限度检查：控制菌检查法(3) 导言 下述检验方法是用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物及其限度的方法。本检查方法的主要目的是确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物限度质量标准。当本方法用于这一目的时，应按照下列规定进行检验，包括样品的取样量，并按照下述规定对检查结果进行判断。 可以采用其他的微生物检查方法，包括自动化分析方法，如果可以证明该方法的效果与药典中的方法等同。 一般程序 样品的制备方法参见通论2.6.12。 如果供试品有抗微生物活性，按照通论2.6.12中描述的方法尽可能地去除活性或对其进行中和。 如果在样品的制备过程中使用了表面活性剂，应按照通论2.6.12中的要求，确认其对微生物无毒性以及其与灭活剂的相容性。 培养基的生长促进作用和生长抑制作用，试验方法的适用性和阴性对照试验 必须确定本检验方法具备检测供试品中微生物的能力。如果检测性能或者是产品发生变化，则必须对方法的适用性进行确认，因为这可能会对检测结果产生影响。 3-1.试验用菌株的制备 使用符合标准要求的稳定的试验菌种菌悬液或按照以下方法制备菌悬液。采用种子批培养维护技术（种子批系统），从原始主种子批计，种子批传代次数不得超过5代。 3-1-1. 需氧菌 将各个试验用菌株分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30-35℃培养18-24小时。将白色念珠菌试验菌株接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，于20-25℃ 培养2-3天。 金黄色葡萄球菌，例如 ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 或 NBRC 13276; 铜绿假单胞， 例如 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 或 NBRC 13275; 大肠埃希菌，例如ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 或 NBRC 3972; 肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型，例如 ATCC 14028 或以肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型，例如NCTC 6017 或CIP 80.39作为替代菌种; 白色念珠菌，例如 ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 或 NBRC 1594. 使用pH为7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH为7.2的磷酸盐缓冲液制备试验用菌悬液。 菌悬液应在2小时内使用，如果菌悬液在2-8?℃条件下保存，则应在24小时内使用。 3-1-2. 梭状芽孢杆菌. 使用生孢梭菌，例如ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或ATCC 19404 (NCTC 532 或 CIP 79.03) 或 NBRC 14293。在厌氧条件下将生孢梭菌试验菌株接种在梭菌增菌培养基中，于30-35℃条件下培养24-48小时。或者是制备新鲜的有活性的生孢梭菌菌孢子悬液，然后进行稀释，获得稳定的孢子混悬液用于接种。该稳定的孢子悬液可在2-8?℃条件下保存，并在经过验证的贮存期内使用。 3-2. 阴性对照试验 为了确认试验条件是否符合要求，应该用所选用的稀释剂代替供试品进行阴性对照试验。阴性对照试验应无菌生长。按照第四部分对供试品进行检测时，也需要做阴性对照试验。如果阴性对照试验结果不符合要求，应进行偏差调查。 3-3. 培养基的生长促进作用和生长抑制作用 每一批成品培养基，以及每一批由脱水培养基或按规定处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。 按照表2.6.13.-1的要求，对相关培养基的适用性进行确认。 液体培养基的促生长能力检查：分别将少量的（不超过100 CFU）的相应试验菌种接种在适当的培养基中。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检查的培养基试验管有清晰可见的微生物生长。 固体培养基的促生长能力检查： 用涂布法分别接种，每个培养基平皿分别接种少量的（不大于100 CFU ）相应试验菌种。 然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小和形态特征应一致。 固体或液体培养基的抑制能力检查: 在相应的培养基中接种不少于100CFU的相应试验菌。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不小于试验规定的最长培养时间。试验菌应不得生长。 培养基的指示特性检查：用涂布法分别在每个相应的培养基平皿中接种少量的（不大于100 CFU ）相应试验菌种。然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养一定的时间。与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，菌落大小形态