原代细胞培养和死活细胞鉴别血球计数实验SOP.docVIP

原代细胞的培养与鉴定标准操作流程（SOP） 一、【实验目的】 1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程（此处以动物小鼠为例）。 2.学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 3.了解细胞损伤的过程及死活细胞的鉴定方法。 二、【实验原理】 (一) 细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物或者人体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二) 细胞死活鉴定 在显微镜下活细胞细胞膜完整、立体感强，胞质透明度好，颗粒状物质少；死细胞膜破裂，无立体感，细胞通透性差，有颗粒状物质、空泡。 培养好的细胞培养液颜色呈土黄色，透明度好，不浑浊，发亮，有浑浊可能是污染初期或细胞太多。 染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，原理：因为活细胞的细胞膜具有选择透过性，细胞不需要的物质通常不能进入细胞，染色剂中如台盼蓝就不能进入细胞，因此用该染色剂处理细胞后，细胞不会被染色，由于死细胞的细胞膜是全透性的，因此台盼蓝能进入死细胞，从而可以使死细胞染色。依此染色便可以判断细胞的活性。DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。 荧光排除法 生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞无荧光。 解剖剪，解剖镊，棉球，培养皿，酒精灯，75%酒精，移液枪，无菌操作台，培养箱，正置光学显微镜，倒置光学显微镜，吸管，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。 四、【实验材料】 小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液等 五、【实验步骤】 (一) 细胞的原代培养 1. 取材： 取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。 2. 分离脾细胞： 用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。 吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min离心5min。 3. 培养脾细胞： 取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。 (二) 细胞死活鉴定及计数 1. 试剂配制：用生理盐水配成4%Tyrpen Blue染液，备用。使用液是0.4%Tyrpen Blue浓度。 2. 染色计数： 取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，将染液：细胞按1:9加入。混合。2min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况。 3. 计数： 在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的中间方格四角和中间5个小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。 4. 计算细胞活力： 根据公式： 活细胞率（%）={（细胞总数—死细胞数）\细胞总数}*100% 六、【实验结果】 Tyrpen Blue染液，活细胞不会被染色而呈无色，死细胞会被其染色而呈蓝色。 分别计算结果： 数目 死细胞（个/ml） 活细胞（个/ml） 活细胞率（%） 死细胞率（%） 细胞活力（%） 七、【注意事项】 1、严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。 2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。 3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞。 4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。 5、实验者离开