实验六活性污泥对蚕豆根尖微核率的影响.docVIP

实验六 活性污泥对蚕豆根尖微核率的影响 一、实验目的及意义 （一）实验目的 1、了解环境诱变物对微核产生的原理。 2、掌握微核试验技术。 3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义。 （二）实验意义 1、通过测定活性污泥对蚕豆根尖细胞微核率的诱变作用，来判断活性污泥对植物的致突变作用。 2、用微核率评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤作用。 3、通过本实验的实验结果可以为活性污泥二次利用的安全性评价提供科学依据。 二、实验原理 微核是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形，比主核小（一般为主核的1/3以下），故称微核。 三、器材和药品 1.为什么要以蚕豆根尖为试验材料？ （1）染色体数较少（2n=12)且体形大，非常适合显微镜下观察； （2）对诱变物的反应较敏感，微核本底值低； （3）根尖分生组织有大量的细胞同步进行有丝分裂； （4）便宜，经济效益好； （5）操作简单。 2.活性污泥（来源于校区周边一生活污水处理厂） 松慈青皮豆(Vicia faba) （选取大小较为均匀、饱满的个体） 3.仪器 显微镜、温箱、恒温水浴锅、冰箱、手揿计数器、解剖盘（或用铝制饭盒）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等显微压片试剂用具。 4.药剂 （1）卡诺氏固定液 （2） 5 mol/L HCl （3） 改良苯酚品红染 四、方法与步骤 1. 蚕豆浸种催芽（3-4d）； 2. 被不同污泥体积比处理根尖； 本实验设6个实验组，分别用空白、0.1g、0.5g、1g、3g、5g的活性污泥与100mL的蒸馏水配制。每组用5~6个蚕豆（1d），设蒸馏水处理为空白对照。 3.根尖细胞恢复培养（1d）；24小时后，用蒸馏水洗根尖2次，蒸馏水恢复培养24h。 4.固定根尖细胞（1d） ： （1）将恢复后的种子，从根尖顶端切下1厘米长的幼根放入空瓶或试管中，加卡诺氏固定液固定24小时。固定液的用量为材料体积的15倍以上。 （2）固定后的幼根如不及时制片，可换入70%的乙醇中，置4℃的冰箱内保存备用。 5.水解分离 将固定后的幼根用蒸馏水浸洗3次，每次大约5分钟，放在试管内加水解分离液2毫升，室温下处理8-10分钟，到幼根软化为止。软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去水解分离液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄能轻压碎好。 6. 染色压片 改良苯酚品红染色法：解离后材料水洗3min并吸干，用剪刀剪下1～2mm左右长的根尖，置于清洁的载玻片上夹碎捣烂，滴1-2滴改良苯酚品红染液染色10～15min后，加盖清洁的盖玻片。再在盖玻片上加以小块滤纸，轻轻敲打压片。 7.镜检及微核识别标准 将制片先置显微镜低倍镜下，找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相对较多的部位，再转到高倍镜（物镜40×）下进行观察。 每个实验组观察5个以上根尖，每个根尖计数约500个细胞中的微核数。 五、数据处理 a. 微核识别的标准： ①大小为主核的1／3以下，且与主核分离。 ②着色与主核相当或稍浅。 ③形态可为圆形、椭圆形、不规则形。 b. 微核千分率（MCN‰）= 判定标准：在10‰以下时，无污染，为环境本底； 10-18‰时，有轻度污染； 18-30‰时，有中度污染； ＞30‰，有重度污染。 c. 污染指数判别： 1.此方法可避免因实验条件等因素带来的微核千分率本底的波动。 2.判定标准： 污染指数在0～1.5区间为基本没有污染； 1.5～2区间为轻污染； 2～3.5区间为中污染： 3.5以上为重污染。 六、实验结论与分析 蚕豆根尖微核检测记录表 镜检日期2016/07/13 镜检者：尹文渊 体积比（样品编号） 微核数 污染指数（PI） 微核千分率（MCN‰） 空白（1） 1 1 2 0.1﹪（2） 2 2 4 0.5﹪（3） 3 3 6 1.0﹪（4） 4 4 8 3.0﹪（5） 6 6 12 5.0﹪（6） 6 6 12 实验结论 根据微核识别的标准判定有轻度污染，根据污染指数判别判定则有部分转换为有重度污染。 八、实验心得 活性污泥对蚕豆根尖微核率的影响实验中，由于天气的炎热加上同学们充满爱心的培养，蚕豆芽历时3天就长到1cm长，接着用不同浓度的活性污泥溶液对豆芽染毒，后经过恢复培养、固定、水解、制片等步骤，最后通过显微镜观察污泥诱变产生的微核，通过计算微核千分率可知随着污泥浓度的增加、蚕豆根尖细胞的畸变率也增加。