植物显微技术(经典完整版).docxVIP

植物显微技术1、任课教师：李岩、刘朝辉（中国农业大学生物学院）2、课程内容及安排：(1) 植物制片技术 (2) 光学显微镜技术从校历的第6周起每周一次实验，分3组，每组不超过16人。实验时间（周四下午2：00，周五上午8：30，周五下午2：00 ）。实验地点：新教学楼1325（显微技术室）。3、教材及参考书：（1）生物学显微技术，余炳生、张仪编著。（2）植物显微技术实验指导，余炳生、张仪、李岩编著。第一部分植物制片技术 第一章概论 第一节制片的目的及意义 一、人类对自然的认识过程 二、显微镜在人类认识自然中的作用 三、制片技术在显微镜应用中的必要性 一1、 a、 b、 2、 a、 b、 c、第二节植物制片技术的分类与发展 、植物制片的分类 按保存时间可分为 临时制片 永久制片 按制作方法可分为 活体观察 切片法 非切片法 二、植物制片技术的发展 1、固定剂及固定方法的改进 2、塑料包埋剂的应用与发展 3、荧光及免疫荧光定位技术的应用与发展 4、活细胞显微观察技术的应用与发展 5、GFP(Green Fluorescence Protein，绿色荧光蛋白)技术 的应用 第二章植物制片的基本步骤和原理 第一节选材 一、选材的原则 二、选材注意事项 三、一般植物材料的切取 根、茎的切取 叶的切取 材料的体积问题 第二节杀死、固定和保存 一、杀死、固定和保存的概念 1、基本概念 杀死：利用某种方法使细胞的新陈代谢瞬时停止。 固定：在杀死的基础上，把细胞或组织按生活的状态固 定下来，使在以后制片的过程中保持状态不变。 2、杀死与固定的关系 3、保存与保存液 70%乙醇 4、制片的核心问题 如何在制片过程中保持生命的真实结构？！ 二、固定的理论 (一) 两类固定剂 1、非凝固型固定剂：使蛋白相互胶联。 2、凝固型固定剂：使蛋白沉淀。 (二) 固定的目的和理想的固定剂 1、固定的目的 2、理想的固定剂（？） 一般而言：非凝固型固定剂优于凝固型固定剂；混合固定剂 优于单纯固定剂。 三、固定剂 (一) 凝固型固定剂 1、酒精(ethyl，alcohol) 常用95%酒精及纯酒精 特点、使用范围、作用原理及注意事项 2、铬酸(chromic acid) 特点：易潮解，为强氧化剂 缺点：渗透力弱，易使组织发生收缩 一般与其它成分配成混合固定液 3、苦味酸( picric acid ) 特点：渗透力弱，易使组织发生收缩，易爆炸 一般与其它成分配成混合固定液 注意事项：一般用50%、70%酒精清洗 4、醋酸( acetic acid ) 特点：渗透力强，可使组织产生膨胀作用 (二) 非凝固型固定剂 1、甲醛( formalin ) 特点：气体，在水中的溶解度为38%左右，很好的硬化剂，强还原剂；渗透力弱。 2、重铬酸钾( potassium dichromate ) 特点：强氧化剂，强硬化剂；渗透力弱。 常与其它固定剂配合使用。 3、锇酸(osmicacid) 特点：强氧化剂，中性；渗透力极弱。 电镜固定常用的固定剂；也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂。 4、多聚甲醛(paraformaldehyde) 特点：白色固体，固定能力较弱，可以保持酶及蛋白的活性。 免疫荧光定位常用；一般用缓冲液配制成4%的固定液。 5、戊二醛( glutaraldehyde ) 特点：能与蛋白质分子的氨基和肽键连接形成交连；是最常用的非凝固型固定 剂。可以部分保持酶和蛋白质的活性。固定能力比甲醛强。常用于电镜制片的固 定；用缓冲液配制。 (三) 混合型固定液 混合型固定剂的内涵 混合原则：a、优缺点互补；b、膨胀与收缩相互平衡；c、强氧化剂与还原剂应分别配置。 1、酒精-甲醛液 70% 酒精100 ml 甲醛2 -10 ml 特点：不易收缩，过去常用于固定花粉管。 2、甲醛-醋酸-酒精液( FAA ) 50% 或70% 酒精9 0 ml 冰醋酸5 ml 甲醛5 ml 特点：过去称“标准固定液”或“万能固定液”；是组织形态中常用的固定液；同时可 兼做保存液。 3、酒精-醋酸液 其中常用为卡诺液( Carnoy ) 纯酒精15 ml 冰醋酸5 ml 特点：具强渗透力，作用迅速；常用于染色体压片法的固定。 4、铬酸-醋酸-甲醛液 又名拉瓦兴液(Nawashin)。1912年首创。 常用为冷多夫(Randoph)改良液。 分为甲乙两部分，用前等量混合。 甲液：铬酸1.5 g 冰醋酸1 0 ml 蒸馏水9 0 ml 乙液：甲醛4 0 ml 蒸馏水6 0 ml 特点：渗透慢，不能长期保存；主要用于显示分裂相。一般用海氏苏木精或番红-结晶紫-桔红 G三重染色。 5、苦味酸液(波茵氏液) 甲液：1% 铬酸5 0 ml 10% 醋酸2 0 ml 乙液：甲醛2