流式细胞仪用技术方法).docVIP

?流式细胞仪常用技术方法 细胞周期/DNA分析（PI法） 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤 1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清； 2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散； 3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打； 6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min； 8.用300目滤网过滤，上机检测。 ? ?细胞周期/DNA分析 (BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit) 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下1-6） 三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管 肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1 四、实验步骤 1.??????? 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心； 2.??????? 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。 3.??????? 室温离心，300g×5min； 4.??????? 重复2、3一次； 5.??????? 弃上清留大约50ul下面的液体，加入1ml Buffer Solution重悬细胞； 6.??????? 计数细胞，用Buffer Solution将细胞密度调为1×106个/ml； 7.??????? 染色： A．?????? 取0.5ml含细胞5×105个； B．??????? 每管加入250ul Solution A，用手轻拍混匀（勿用漩涡混匀）； C．?????? 室温反应10min，保留Solution A； D．?????? 加入200ul Solution B，轻轻混匀； E．??????? 室温反应10min，保留Solution A+B； F．???????? 加入200ul冷Solution C，轻轻混匀，黑暗处2-8孵育10min； 用50um尼龙网过滤细胞，加入上样管上流式分析（3h内分析完）。 ? ?淋巴细胞亚群分析 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤 1.采集血液样品，取100ul抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。 2.轻轻混匀，依次加入20ul Isotype Control(如没有的话用没染色细胞代替)，另外几管加入20μl荧光抗体。室温避光保存20分钟。 3.加入1×红细胞溶解液450μl，涡旋混匀避光保存10min，待管内液体透亮，300-500g离心5min，去上清 4.加PBS 2mlPBS涡旋混匀，300-500g离心5min，弃上清，然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网，4避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS，放4冰箱保存，48h内上机检测。 ? ?Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡 （BD公司Annexin-FITC/PI试剂盒） 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这