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扫描电镜样品制备的几个问题 临界点干燥 1.原理 根据分子物理学，理想气体的状态方程为： 图中oa段，P随?的增加而增加，近似于理想气体。ab段为气液共存， 压强保持在饱和蒸汽压. a点的密度为该温度b点的密度为该温度下气液 共存时的液体约密度。ab之间各点，表示气液可以按比例共存，相当的? 值代表该状态下相应的密度。bd表示全部液化后，随压强的增加，密度? 仅有缓慢的增加，表明液体难以被压缩。 在不同温度下，实际气体的等温线如图所示。温度较高 (T3)时，近于 理想气体；温度较低(T1 ,T2 )时，有液化过程。温度越低，液化过程越 长。温度逐渐上升，液化过程越来越短，到达一定温度，可缩短为0。 在此温度下，气体到液体的转变是突然的，两者的密度相等，如图中 的c点。这一温度称为临界温度(Tc)。c点的压强，称为临界压强(Pc)。 因此，物质的临界温度就是对该物质加压时能液化的最高温度。高于此 温度时，无论对该物质施加多大压强，它也不被液化。物质的临界压强 就是它在临界温度下，能被液化所需施加的最小压强。低于此压强，该 物质是气体；高于此压强是液体。在临界状态，界面消失，液气共存， 而且两相的密度相等，表面张力等于零。若在此时干燥标本，则标本不 会受表面张力的损伤。生物组织含有大量水，若于固定后在水的临界状 态下进行干燥，生物组织定遭破坏。目前国内外实验室几乎都用C02为工 作介质进行临界点干燥。 2.临界点干燥操作 图示意二氧化碳临界点干燥装置。标本经过固定及脱水后(如用乙醇脱水，往往再用醋酸异戊酯浸泡，将乙醇置换)迅速放入耐高压的样品室中，然后充以液态CO2，使CO2液体占样品室容积的50一80％然后升温，使温度超过CO2临界温度，达400C左右，压强超过其临界压强，达100大气压左右。在此过程中，C02经过全部液化然后突然全部气化，成为400C左右的气体，最后等温放气，降到大气压。待温度降到室温后，即可取出干燥的样品。整个干燥过程CO2的物态变化如图所示。在温度To(一般低于室温l00C)充CO2，样品室中CO2的状态从1(此时压强为l大气压)升压到2，再液化到3，这是等温充液过程，压强增大。由于CO2质量增加，密度增大。在由To升温到Tm的过程中，物态由3到4，即升温升压液化过程。到4时全部液化，由4到5，C02液体升温到临界温度Td，经过5时，C02液体全部同时转变为C02气体而不出现气液界面。由5到6，气体升温到Tm。此时等温放气，物态由6到7，此时压强降为1个大气压．再降温到室温，物态到7到8。由l到8就是样品室中工作介质C02物态变化的全过程，由物态变化全过程的分析来看，临界点干燥的关键步骤是由3到6。即必需全部液化再全部气化，才能避免气液分界的出现，克服表面张力对样品细微结构的损伤。 3.临界点干燥失败的原因 临界点干燥法固然是个好方法，但操作有误也会失败。常引起的原因如 下： (1)C02量不够；一般C02液体应充至样品室的50％一80％。若C02充量不 够，样品室中的C02密度小于?c，则升温气化时物态将沿c点左侧的3’、4’、 5’、6’竖直线变化。由3‘到4’不是液化而是气化，到4点，全部变为气体。 这样便不是临界点干燥，而是类似自然干燥。 (2)样品上粘附酯酸异戊酯过多；由于醋酸异戊酯不易挥发，C02气体排 出后，样品室便留有残余的醋酸异戊酯，因而干燥不充分。 (3)样品室封闭不严密；由于干燥前未拧紧放气阀，或放气阀橡皮垫圈 不紧，或由于样品室盖橡皮垫圈老化等原因，导致样品室不能密闭，使 充入的CO 2泄漏，其后果与I相同。 (4)待干燥样品量过大，这一方面把多量醋酸异戊酷带入，另一方面盛 样品的小金属盒在样品室占据的空间过大，使C02量相对不足，因而干燥 不充分。 二、真空干燥法 样品按普通扫描电镜标本制备方法进行固定和乙醇系列脱水，然后将 其由l00％乙醇移至100％乙醚中，再将样品投入装满液氮的高约5cm的金 属杯中使之冷冻。把装有冷冻样品的金属杯放入真空装置中，用旋转泵 抽气。由于在封闭空间体积不变的情况下，压力降低会引起温度下降， 液氮变为固态氮并且升华。然后样品中的乙醇也升华，样品干燥。 可以用乙腈干燥标品，其步骤如下：样品按一般方法固定，用浓度递 增的乙腈系列(50％一100％)脱水 (每次脱水时间需20mln)。用容量约 1m1的铝制容器装满乙腈，把已脱水的样品放入。将该容器放入真空装置 中。抽真空，容器骤冷，乙腈成为固态。继续抽真空时乙腈升华。样品 干燥。 ? 四、样品的冷冻处理 为了减少冰晶对组织的损伤，在冷冻前可用冷冻保护剂处理标本。冷冻 保护剂有PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、甘油、蔗糖、二甲基亚砜等，各有优