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细胞受控组装人工喉软骨支架及性能表征摘要：目的 应用组织工程和生物制造工程原理，采用增材制造技术，探索一种制造喉关节软骨支架的新途径。方法 利用明胶和海藻酸钠作为材料，通过CCA-II细胞受控组装机制备喉软骨支架，然后对所制备支架进行性能的表征。结果 制取出了粘度合适、降解率合适、高孔隙率和含水量的三维支架，类似喉软骨外基质成分。结论 增材制造技术与组织工程技术和生物制造技术的结合为未来修复喉功能提供一种潜在的手段。关键词：人工喉软骨；增材制造；细胞受控组装；生物3D打印1喉软骨支架制备方案所谓组织工程就是运用工程科学和生命科学的原理和方法，从根本上认识正常和病理的组织结构--功能关系，研究和开发一套具有生物相容性、组织相容性和生物活性的组织器官[1-3]，用以替代或修复已损伤的人体组织和器官，或进一步改进受损组织器官的生理功能。具体做法是：首先制备具有良好生物相容性和良好机械性能的生物材料支架，然后将种子细胞与生物材料支架混合培养，植入受损部位，待细胞生长、增殖、分化形成与原来组织器官具有相同形态，并且具有和原来组织器官相一致的生理功能的具有生物活性的组织器官替代物，同时生物材料支架也按照细胞生长、增殖、分化相匹配的速率降解，从而达到组织器官损伤修复和恢复其生理功能的目的[4-7]。通过组织工程和生物3D打印技术原理，本文研究过程主要为以下内容：喉软骨支架的生物材料的选择和喉软骨支架的制取。其中主要为降解率合适、孔隙率高、含水率高且生物相容性好的喉软骨支架。支架组装过程如图1所示，支架制取实验在CCA-II细胞受控组装机中完成。2喉软骨组织工程支架材料的选取2.1喉的组成成分 成人的软骨，根据软骨组织内所含纤维的成分不同，可分为三种类型，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。而喉的软骨属于透明软骨，是一种自身没有血管，没有神经，没有淋巴组织的特殊结构。在透明软骨中软骨细胞仅占软骨组织体积的1～5%。软骨细胞的营养都是由软骨基质来提供的。软骨细胞是一群比较特殊的细胞同时自身能够合成和维持软骨基质的底层结构[8]。因此，如何选取合适的支架材料对整个喉软骨的作用至关重要。2.2材料的选取 根据喉软骨组织的组成成分以及其结构特点，理想的喉软骨组织工程支架应该具备以下特征：①良好的生物相容性，对细胞和机体无毒害；②良好的生物降解特性，可完全被机体降解吸收或排出体外；③良好的机械特性，具备一定的力学强度和可塑性，结构长时间保持稳定，具有较高的孔隙率；④良好的表面相容性，利于细胞在材料表面黏附与生长[9]。目前可作为喉软骨组织工程支架的材料具体可分为三类，分别为天然高分子材料、人工合成高分子材料以及复合材料。天然高分子材料如胶原、壳聚糖等均取自天然动植物体，其都是软骨细胞外基质成分或类似基质构成物，所以此类材料能够很好的与生物体相容，有良好的仿生性和组织亲和性，并能够促进细胞的增殖，且大多来源丰富，价格低，但也有质地相对较软，机械强度不足的缺点。而合成材料则是在天然材料的基础上发展起来的，虽然在机械强度上能够满足需求，但其亲水性差、细胞吸附力弱则是其与天然高分子材料相比不足之处。而复合材料的出现则改变了上述两种材料的不完美，它即具备了天然材料组织相容性和亲和性好的优点，又提高了材料的机械强度，使得喉软骨组织工程支架的材料变得更具可行性。根据复合材料的这些优点，本文采取制备明胶与海藻酸钠复合材料的方法来喉软骨组织工程支架，其中明胶是胶原的部分变性衍生物，在35℃以下时形成热可逆性凝胶，具有高含水率及温敏性[10]。海藻酸盐可在Ca2+、Ba2+等二价阳离子的作用下发生溶胶凝胶相转变，具有良好的机械强度和成形性。将二者相结合，得到含水率高、易于成形的明胶海藻酸钠复合材料（GSA），在化学成分、柔软性、对亲水性营养和代谢物扩散性等方面都与ECMs相似[10]，可用作基质材料。其次，该材料模仿天然软骨的蛋白多糖水凝胶基质（含水85%～90%），可以作为喉软骨的修复或替代材料。最后，该材料是由亲水性聚合物经水溶胀形成的，软骨细胞可渗透入其中进行生长。将该材料制成多孔状，软骨细胞还可由微孔进入多孔水凝胶内部生长[11，12]。3支架的制取实验本实验在CCA-II细胞受控组装机中完成。首先把经Mimics处理过的STL格式三维模型导入计算机中，再用Aurora软件对该模型分层，得到CLI文件。将得到的CLI文件导入Cark软件中，准备Cark控制软件来完成对组装机进行控制。设定系统组装参数如表1所示，实验前设定组装机温度在10℃，预冷30min。具体过程如下：①首先分别称量浓度为20%的明胶溶液以及浓度为4%的海藻酸钠溶液；②将称量好的明胶与海藻酸钠加入0.9%生理盐水中制作成相应浓度的共混液，并在65℃水浴锅中加热30min，边加热加用玻璃棒搅拌；③将海藻