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基因工程实验流程总览 构建基因组文库 真核生物有成千上万个碱基对，单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。 油菜TOC33基因片的克隆 实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号。 实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。 具体实验步骤 Ⅰ.植物基因组DNA的制备 Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化 IV. DNA片段的体外重组与转化 V. 克隆的筛选与鉴定 VI.序列分析 Ⅰ.植物基因组DNA的制备 取0.2g样品嫩叶至1.5mL EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL 抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。 12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。 沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0，RNase A 30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。 加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min ，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ul ddH2O溶解备用。 Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增 引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物: 上游引物P1: 5一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3， 下游引物P2：5一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3。 在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系： 10×PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul Primer 1 1.0 ul Primer 2 1.0 ul Taq 酶 0.5 ul 模板 1.0 ul ddH2O 16.5 ul 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1)?称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 2)???取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。 3)?将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。 4)?待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。 5)??用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。 6)?接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳； 7)??当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。 8)?将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。 电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟； 倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r/min离心1分钟； 倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟； 倒掉上清，重复步骤三； 倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟； 把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。 IV. DNA片段的体外重组 加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。 IV. DNA片段的转化 1.???? 从液氮中取出感受态细胞，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。 2.???? 42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5mlEP管）