液相色谱实验基础幻灯片.ppt

液相色谱基础 本章内容： 液相色谱发展史 液相色谱的基本概念 影响峰形扩展的因素 历史回顾 在线真空脱气机工作原理 六通阀之扎针 六通阀之装样 手动进样器 色谱数据处理装置 1.计算机 2.色谱工作站 正相、反相色谱的划分标准：比较流动相和固定相的极性大小。 正相色谱：流动相极性固定相极性 反相色谱：流动相极性固定相极性 正相色谱：分离在水中绝对不溶解的物质或同分异构体，占10%应用； 反相色谱：用于常规分析，占~80%的应用。 离子对色谱：可看作是反相色谱的一个特殊应用，需要在流动相中加入离子对试剂。 离子交换色谱：需要特殊的柱子和检测器，与离子对色谱的应用范围相同但原理不同 体积排阻色谱：大分子先流出，小分子后流出。不同的柱子分离的分子量范围不同。需要专门的软件。 水相流动相：凝胶过滤色谱GFC (Gel Filtration Chromatography)； 有机流动相：凝胶渗透色谱GPC (Gel Permeation Chromatography). 死时间t0：完全不保留组分流出系统的时间。 液相色谱中死时间的几种测定方法： 1.有响应的溶剂出峰时间为死时间； 2.进样后的阀切换峰，对应的时间为死时间； 3.工作站中输入柱子的空余体积，自动计算。 （对于C18柱，也可以用硝酸钠或硫脲来测定） 分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度，其数值应该有合理的范围： R太小，两个峰无法彻底分离； R太大，分离时间过长，工作效率低下。 一般要求R大于1.5，也可遵循行业特殊规定。 需要记忆该公式以便优化实验条件，提高分离度R。 从数学推导来看，分别增大N, α, k’值，都可以提高分离度R。 R是A，B两个峰之间的分离度。 容量因子k’为物质的特性，当分析条件一定时，其为定值。 溶剂的洗脱强度强弱与其极性有关： 反相色谱：溶剂的极性越强，洗脱强度越弱。 正相色谱：溶剂的极性越强，洗脱强度越强。(注意：不可以使用纯水作为正相色谱的流动相) 一般分析要求：2k’5 复杂样品分析时，可以 2k’10(或20) 尽量通过优化前几种实验条件来提高α值，避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本。 升高温度可以提高分离选择性，但不要温度过高，以保护柱子。（60℃就已经算是高温了！） 注意：温度对平衡常数有影响，有时会影响出峰的顺序，注意对化合物进行定性后再定量。 升温可以加速分离，缩短分析时间。 上下两张色谱图的k’,α值完全一致，仅仅是由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。 峰的锐度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高。从定量的角度上，用理论塔板数N来衡量柱效的高低，见下页。 荷兰科学家范德姆特提出了范德姆特方程，给出了影响柱效高低的三种因素。 以下几页的柱内效应，仅供大家了解、参考使用。 涡流扩散（多径扩散）：因为流动相所通过的路径不同，所以导致带宽扩展。 纵向扩散：分子有从高浓度向低浓度扩散的特性，由于浓度差而产生的扩散。 该扩散对GC影响显著，在低流速下影响显著。 传质阻力：包括滞流流动相以及固定相C18与溶质间的溶解、解析保留作用。 ***是影响LC柱内效应最关键的一项 与柱内效应相比，柱外效应对柱效的影响更大。 死体积(Dead Volume): 从进样口到检测器出口。 延迟体积（Delay Volume): 从溶剂入口到柱子入口。 因为R=Δt/W，所以提高分离度的两大角度为：增加Δt或降低W。 右图单向阀仅可使溶剂从上向下流。 单独一个泵腔无法满足溶剂传输系统的要求：连续性、稳定性都不符合标准。 1.进样量: 要么小于定量环体积的一半, 要么满刻度进样(需要推进3~5倍定量环体积的样品). 2.进样动作: 在Load状态推针，动作要平缓,以防样品冲出, 进样后先切换到Inject状态,再拔针,以防倒吸,产生气泡. 3.清洗: 在Inject 状态清洗进样口. 4.废液口: 废液管的出口末端应与进针口水平，以防样品倒流泄漏或产生虹吸. 思考：如果From Pump和To Column的连接颠倒，有何影响? 结论：不要接错任何管路！可将说明书上的连接示意图贴在仪器旁边，以便参考。 质谱检测器的比例日益增长,因为使用质谱检测器可以帮助定性! 本章内容仅供参考。 50μm填料缺点：机械强度低，传质阻力大，柱效低。 30μm填料缺点：比表面积小，吸附不充分，分离度不好。 3~10μm填料最常使用。 如果表面硅羟基键合不完全，会有二次保留效应，使得峰形发生扩展，所以对裸露的硅羟基要实行封端(封尾)技术。 常见封尾技术有: 1.空间位阻:甲基换成异丁基或异丙基. 2.双封端法:用C18和甲基同时封端. 3.其他技术. Agilent HPLC1100系统采用积木式堆积结构，方便