实验四-离心技术及物质代谢实验课件.pptVIP

离心技术 概念： 根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。 应用： 分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。 RCF(relative?centrifugal?force) ：相对离心力 rpm( revolutions per minute ) ：每分钟转速 低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示 沉降系数（S）: 超速离心时，颗粒在离心场中的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位离心力场下的沉降速度。 单位：Svedberg，1S=10-13s 是是物质特有的物理常数，可间接反应分子量的大小。 离心分离技术的基本理论数据，与物质的大小、形状、密度及介质的密度、粘度都有关，通过对离心力和离心介质的选择，即可分离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。 另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。 离心机的类型和主要构造 类型 工业用离心机 离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机 主要构造 转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系 统，制动装置，指示表盘 转头 1．角式转头 2．荡平式转头： 这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。 3．区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。 4．垂直转头： 其离心管是垂直放置的。 5．连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。 最大额定转速—— 一定的使用限度，使用一定次数或一 定时间后递减10%。 离心管 不锈钢和塑料离心管，管帽防止样品溢出。 离心操作的注意事项 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。 血清胆固醇测定（酶法） 【实验目的】 1. 了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。 2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义。 血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE, 70%)和游离型胆固醇(FC, 30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ-4--胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下： 1. 标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。 2.取试管3支，编号，按下表操作。 【计算】 ΔA标本 CHO（mmol/L）= —————— × 标准液浓度 ΔA标准 【标准液】 胆固醇 5.17mmol/L（200mg/dL） 【正常参考范围】 3.10～5.70mmol/L 血清甘油三酯的测定（ 酶法） 【实验目的】 1、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。 2、掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。 血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（