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生物大分子的分离纯化技术 生物样品的特点: 生物活性 复杂性 内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术 生物样品的常规分离纯化方法 透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心 透 析 Donnan效应: 盐析 基本原理： 在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，即盐析。 盐析实验应注意的问题： 盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃) 盐的饱和度： 温度：室温或4℃ pH：等电点 蛋白质的浓度： 冷冻干燥 基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥的方法。 冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度，13~40 Pa。 离心 基本原理 种类： 普通离心机（6000rpm)， 高速离心机(25000 rpm)， 超速离心机 转子：固定角度式， 悬挂吊桶式 离心(2) 离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)： F=mω2r; Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r 沉淀速度与沉降系数： F摩擦=fv F净=(Mp-Ms)ω2r-fv 沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围. 以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示. 离心(3) 离心技术的类型： 最大速度方法： 移动界面（Moving Boundary)超速离心法 移动区带(Moving Zone)超速离心法 等密度方法(Iso-density)： 临床及生化分析样品的预处理 样品的类型、采集与保存 酶样品的准备 样品的类型、采集与保存 样品的类型： 样品的类型、采集与保存 样品的采集 血样： 全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml) 血浆：2000g离心10min 血细胞： 血清：5~30 min自凝分离 尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH2.5)， 碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌） 唾液： 组织样品：液氮等冷冻 酶样品的准备 酶活性的保持 控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如: BSA 加入辅助因子保护活性部位, 如: EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如: 氟代磷酸二异丙酯，甲（乙） 酰-亮-亮-精三肽等 亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等 样品制备 从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品 （5000 rpm,15 min) 从细胞培养液制备样品 电泳分离纯化技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 高效毛细管电泳 电泳分离纯化技术 基本原理 V=μe E (μe 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.) 影响电泳分离的因素: 物质本身的结构和性质: 荷电性质, 形状 支持介质: 吸附作用,电渗作用 溶液介质: pH, 离子强度 电场强度: 常压 500 V 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质 凝胶的机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝胶的总浓度: 聚丙烯酰胺凝胶电泳(2) 凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel): 10cm×6cm 板型(Slab Gel): 12cm×12cm或14cm×16cm; 玻璃板间距1.75或1.5 cm. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量 1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇