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LexA酵母双杂交系统流程 LexA酵母双杂交系统流程 酵母双杂交系统优点 以酵母作为报道株具有研究优势 融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况 敏感性：具有高拷贝强启动子的表达载体；通过mRNA放大信号 简洁性：不需纯化蛋白 真实性：蛋白质体内短暂的相互作用 酵母双杂交系统局限性 存在假阳性和假阴性 要求两个蛋白都要进入细胞核内才能激活转录，对于不能进入核内的蛋白质（膜蛋白、分泌蛋白）的相互作用研究不大合适 有复杂的翻译后修饰的蛋白相互作用研究不大合适 融合蛋白的构建可能会影响到蛋白质本身的活性或折叠状态 细菌双杂交－基于重组cAMP信号转导系统 Cya蛋白在细菌中编码腺苷酸环化酶（cAMP cyclase），催化ATP合成cAMP。 cAMP结合CAP，由CAP结合到基因启动子，激活基因表达。 被激活的基因主要是一些参与代谢调控的基因，如参与乳糖（ lactose ）、麦乳糖（maltose）代谢的酶，包括?－半乳糖苷酶（?－galactosidase） 细菌双杂交－基于重组cAMP信号转导系统 来源于Bordetella pertussis 的Cya是一个很大的蛋白，有1706个氨基酸。 1－400aa是Cya催化区域，该区域可分为T25（1－224）和T18（225－399）两个片断。 两个片断分开，没有催化功能；两个片断结合在一起才有催化功能。 细菌双杂交－基于重组cAMP信号转导系统 在cya基因缺陷的E.coli菌株中，同时转入T25－X，T18－Y。 如果X、Y能相互作用，则激活cAMP信号途径； 如果X、Y不能相互作用，则cAMP信号途径抑制 报告基因：如LacZ 细菌双杂交 LB＋X-gal Zip：酵母中转录激活因子Gcn4的亮氨酸拉链区（leucine zipper），可形成自身二聚体 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置。 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达。 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。 噬菌体 噬菌体展示技术流程图 噬菌体cDNA展示技术 以改构的噬菌体为载体， cDNA基因片段定向插入 噬菌体外壳蛋白基因区， 使外源蛋白表达并展示 于噬菌体表面， 通过亲和富集法筛选 表达有特异蛋白质的噬菌体。 Phage library 一些噬菌体库已经商业化 遗传学方法 合成致死效应（synthetic lethality） 单个基因的突变不能引起致死，而两个基因同时突变则会产生合成致死效果，说明这两个基因所编码的蛋白质在功能上可能是相关的。 合成致死效应的优缺点 是一个体内实验 可以在全基因组范围内进行筛选 工作量大 只适于低等生物 基于质谱的分析方法 串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification，TAP） 大规模的蛋白质相互作用研究 也可用于蛋白质复合物的纯化 系统包括： protein A：结合抗体，抗体和珠子（bead）共价交联 TEV（烟草蚀刻病毒，tobacco etch virus）蛋白酶切割位点(TEV site) 钙调素结合蛋白（CBP）：以Ca2＋依赖的形式结合钙调素，钙调素与珠子共价交联（calmodulin-binding peptide，CBP） 靶蛋白：用于结合所需要的蛋白质 TAP分离过程 将TAP 标签构建到靶蛋白上，在宿主细胞内表达，融合蛋白表达水平接近于靶蛋白的天然状态 与靶蛋白发生相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上形成复合体 细胞裂解物和IgG 基质温育在一起，通过protein A复合体结合到IgG 上 冲洗后加入TEV 蛋白酶，洗脱下复合体 在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被着钙调素的珠子温育，复合体就结合到珠子上 进一步洗去杂质后，加入EGTA螯合，复合体脱落 SDS分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析 TAP分离过程 高通量质谱蛋白质鉴定 使用一分子标签如FLAG 标记靶蛋白，使融合蛋白在细胞内过量表达 通过免疫亲和(FLAG 抗体)捕获到抽提物中靶蛋白形成的蛋白复合体 SDS分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析 高通量质谱蛋白质鉴定的标签（tag） 蛋白质相互作用组（interactome） 建立相互作用组（interactome） 一个生物体、组织、细胞或细胞器中所有蛋白相互作用的集合 建立完整的蛋白质相互作用组 从总体上认识单个细胞、整个生物体工作的机理 从一个新蛋白预测其整体的生物学效应