13.1-荧光免疫概论.pptVIP

6．时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 7．荧光偏振免疫测定的原理是什么？ 8．荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 9．如何评价各种类型的荧光免疫测定？ 10．荧光免疫测定有何应用？ 思考题 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应, 在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测, 分为直接法、间接法和双标记法等。 荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相和非均相。 小 结 荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。 荧光抗体技术 荧光免疫测定 均相荧光免疫测定 （homogeneous fluorescence immunoassay） 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光免疫技术的类型 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 基本原理 时间分辨检测原理示意图 时间分辨 一、时间分辨荧光免疫测定 stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠 stokes位移 基本原理 时间分辨荧光免疫测定 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高 基本原理 发射光谱和激发光谱 时间分辨荧光免疫测定 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高 基本原理 荧光标记物的相对比活性 时间分辨荧光免疫测定 结合β-二酮体 Eu3+解离 酸性增强液 荧光增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 基本原理 信号增强 时间分辨荧光免疫测定 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+) 标记物 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 非特异荧光背景 1～10 Sm3+ -β-NTA 65000 人血清蛋白 4.1 Sm3+-PTA 60000 球蛋白 3.0 Eu3+-β-NTA 714000 细胞色素C 3.5 Eu3+-PTA 925000 FITC 4.5 Tb3+-PTA 96000 丹黄酰氯 14 Dy3+-PTA 1000 罗丹明B 3.0 常见荧光物质的荧光寿命 时间分辨荧光免疫测定 标记方法 双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+ 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检 抗原结合，形成固相抗体-待检 抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧 光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强 度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高 方法评价 时间分辨荧光免疫测定 光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。 偏振荧光(绿光,525nm～550nm) 偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质 基本原理 二、荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，