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* * * * * 2、对蛋白质水平和活性的检测 对蛋白质含量的检测： Akt，JNK，c-Jun， IRS-1， 蛋白质水平内参： β-Actin，GAPDH，α-tublin 对蛋白质活性的检测： p-Akt473， p-Akt308， p-JNK， p-c-Jun， p-IRS， 对蛋白质相互作用的检测： 对蛋白质亚细胞定位的检测： BCL2， （膜转位、核转位和线粒体转位） 十 Western Blot常见问题分析 问题分析1 问题分析2 问题分析3 问题分析4 免疫相关实验技术 免疫印记 免疫共沉淀 → 免疫印记 染色质共沉淀CHIP → PCR 免疫组化 细胞免疫荧光 Thank you for your attention! * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3、支持体：聚丙烯酰胺（Acr和Bis） 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N‘亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶 。 常用的引发剂和加速剂是过硫酸氨(AP)和 N，N，N，N-四甲基对乙二胺(TEMED)。 浓度可在7.5%-15%之间变化。 温度高聚合快，温度低聚合慢。 凝胶成份 丙烯酰胺(Acr)和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) ?? 避光，保存时间 SDS（十二烷基磺酸钠） Tris-Cl 缓冲液 TEMED 避光 过硫酸铵 保存时间（用前加入） 去离子水（ddH2O） 4、不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 浓缩胶：浓缩效应 分离胶：电荷、分子筛效应 分离胶 浓缩胶 胶浓度 7.5% 4% Tris pH8.9 4.00 Tris pH6.8 2.00 Acr+Bis 4.00 1.06 H2O 7.84 4.84 SDS 0.08 0.08 TEMED 10μl 10μl 10%AP 用前加 200 100 总体积 16ml 8ml 堆积作用:凝胶浓度较小，孔径较大， pH=6.8 负极 （低电导区，高电场强度 ） 慢 GLy- (pI=5.97) 中间 Pr- (pI大多接近5) 快 Cl- 正极 在浓缩胶(pH=6.8)中HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。 蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。 电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。 由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 浓缩效应 SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度 5、电泳装置 Bio-Rad 和国产天能 操作图示 6、灌制SDS-聚丙烯酰胺凝胶 灌制分离胶 隔绝空气 灌好后一般室温放置30分钟左右 灌制浓缩胶 插入梳子 7、配胶注意事项 过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整TEMED或AP的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。 插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。 8、电泳注意事项 原则上每次上样前将蛋白重新煮沸变性。 0.75mm厚的SDS－PAGE的10孔梳每孔最多可上蛋白体积为20ul，15孔梳每孔最多可上蛋白体积为10ul。 一般的蛋白每孔上样总量为20ug比较适宜,特殊蛋白特殊对待，0.75mm厚度的胶，每泳道最高承受能力为100ug。 为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积不同时，最好用1×的上样缓冲液补平。 看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。 当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4－0.6mm时停止电泳。 只要被检测蛋白量占总蛋白的1/105, 即可被检测。 9、蛋白marker