真核表达调控-2分子生物学课件.pptVIP

RNAi作用的简单模型 当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。 RNAi研究的一般技术路线 2、siRNA 的设计 何为siRNAs 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。 一般设计原则 （1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 负对照 一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 制备siRNA5种不同方法的比较 制备siRNA5种不同方法的比较（续） 3. RNAi的效果分析 可从mRNA和蛋白质两方面进行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。 蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。 4、RNAi技术的应用 （1）在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。 由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为RNAi技术。 根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。 编码区RNAi技术 自1998年在线虫中发现RNAi现象以来，以基因编码区为靶序列的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。 最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。 这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成dsRNA的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。 为弥补早期RNAi技术的上述不足，Tavernarakis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。 热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默。 编码区RNAi技术 这种改进的RNAi技术与传统的RNAi技术相比，具有明显的优点： 首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析； 其次dsRNA可以被诱导产生，RNAi能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能； 另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。 Kennerdell J. R.和Cart