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芍药籽中几种单萜苷含量的测定 　　（信阳农林学院生物技术系，河南 信阳 464300） 　　摘 要：建立了RP-HPLC法测定芍药籽中单萜苷类含量的方法。芍药苷等单萜苷类物质具有较好的生物活性，目前，芍药中的单萜苷目前主要来源于芍药的根，分析结果表明，芍药籽仁中也含有较多的单萜苷，这些单萜苷也可以作为另一个重要的单萜苷来源。 　　关键词：RP-HPLC法;单萜苷;含量测定 　　0 引言 　　 芍药属毛茛科，双子叶植物纲，为灌木或多年生草本植物。芍药是多年生宿根草本，具纺锤形肉质根。芍药苷是芍药中提取的主要活性成分，具有解痉镇痛和改善记忆、抗自由基损伤等功能和抑制细胞内钙超载、抗KA神经病变的生理功能。 　　 单萜苷类化合物是天然药物中一类重要的化学成分，在植物中广泛分布，是许多常用中药的有效成分，如芍药、牡丹、花椒等。主要有无环、单环、双环、三环单萜苷和环烯醚萜苷等多种结构类型。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验原料 　　 芍药（Paeonia lactiflora Pall.）籽：采自河南省孟津县土桥村花木公司基地，原植物及样品由该公司总经理卫志鹏老师鉴定。 　　1.2 实验仪器与试剂： 　　 仪器： Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦公司）;SENCO W201恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）; FA2004电子天平（天津市天分分析仪器厂） ;YXJ-A高速大容量电动离心机（江苏金坛市环宇科学仪器厂）; SB-2A型紫外分光光度计（天津市天分分析仪器厂）;100 mL容量瓶、1 mL/5 mL移液管、50 mL/100 mL量筒、40 mL/50 mL/80 mL烧杯、100 mL圆底烧瓶等玻璃仪器均来自四川蜀牛玻璃仪器厂;0-100酒精计（河北省武强县同辉仪表厂）;试剂：磷酸，分析纯;乙腈，色谱纯;甲醇，色谱纯;磷酸二氢钾，色谱纯;二次蒸馏水，自制;对照品：4′′-羟基白芍苷，氧化芍药苷，白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1等均为本实验室自制，经NMR和 ESI-MS鉴定了化合物的结构，经HPLC测定纯度大于98%。 　　2 实验条件 　　2.1 色谱条件 　　 Agilent1100高效液相色谱仪;色谱柱：Zorbax SB-Aq C18色谱柱（4.6×250 mm，5?m）;流动相：乙腈-磷酸（0.05），或乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐（pH=3.0）;体积流量为1.0 mL? min-1;柱温：30℃;进样量：10 μL。 　　2.2 对照品溶液的制备 　　 精密称取对照品4′′-羟基白芍苷10.3 mg，氧化芍药苷10.4 mg，白芍苷10.8 mg，芍药苷18.6 mg，paeonidanin 14.9 mg，白芍苷R1 8.1 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，配成浓度为206 μg?mL-1， 208 μg?mL-1， 216 μg?mL-1， 372 μg?mL-1， 298 μg?mL-1， 161 μg?mL-1的混合溶液，即为对照品溶液。 　　2.3 供试品溶液的制备 　　 取采集的芍药种子，脱壳机脱壳，收集芍药籽仁和籽壳，将籽仁和籽壳置于100℃的烘箱中烘3h。将经过烘干的芍药籽壳和籽饼粕粉碎，过60目筛，分别精密称取10.00克样品，用滤纸包好，加入100mL甲醇为提取溶剂，采用索氏提取器回流提取4h。回收提取液，冷却后，滤液用0.45?m的微孔滤膜过滤，定容于100mL容量瓶中，即为供试品溶液。 　　3 实验结果 　　3.1 吸收紫外波长的选择 　　 采用紫外可见分光光度计对制备的6个单萜苷标样溶液在波长200～400 nm间扫描进行全波长扫描。可以看出4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷在260 nm处有明显的吸收峰，白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1在232 nm处有最大吸收峰。因此，本测定方法的吸收波长采用变波长法测定，根据保留时间，测定4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷时选择260 nm波长，测试白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1等时选择测定波长为232 nm。所以HPLC的检测波长为（0～7.5 min） 260 nm， （7.5～22 min） 232 nm。 　　3.2 洗脱流动相的选择 　　 由于单萜苷类化合物含有较多的羟基，这些羟基与固定相作用较强，会导致拖尾。所以文献报道分离芍药苷等单萜苷类的流动相多为乙腈-磷酸水体系[1-3]。本文优化了乙腈-磷酸水体系作为分离流动相的分离效果。发现仅仅乙腈-磷酸水体系难以实现对4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷两种单萜苷的分离。我们参考苷类分离方法的文献[4]报道，对乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐体系对单萜苷类的分离体系进行了优化，最终选择乙腈-