第十一章：放射免疫分析技术课件.pptVIP

第三节 免疫放射分析 * * * 第七章 放射免疫技术 第一节　放射免疫技术 一、原理及分类 二、常用的放射性核素 三、标记物制备及鉴定 四、抗血清鉴定 第二节　放射免疫分析 一、基本原理 二、实验方法及测定 第三节 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA与RIA的比较 思考题 小结 免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。 标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。 标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。 标记免疫技术－基本概念 常见标记免疫技术 放射免疫技术 酶免疫技术 荧光免疫技术 第一节 放射免疫技术 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。 放射免疫 RIA 以标记抗原与反 应系统中未标记 抗原竞争结合特 异性抗体来测定 待检样品中抗原 量。 免疫放射 IRMA 以过量标记抗体 与抗原非竞争结 合，采用固相免 疫吸附载体分离 游离和结合标记 抗体。 放射受体分析 RRA(标记受体检测抗原) 放射配体结合 分析RBA （标记配体研究受体） 其它 一、放射免疫技术－原理及分类 二、放射免疫技术－常用的放射性核素 125I(最常用) 131I 3H 14C 射线 γ（电离辐射弱，对标记物的免疫活性影响小） β（电离辐射强） 理化性 活 泼 差 核素丰度 90% 20% － 半衰期 约60天 8天 12.3年 标记方法 简 单 复 杂 标记设备 低 廉 昂 贵 测量条件 简 单 复 杂 （晶体闪烁计数仪） （液体闪烁计数仪） 常用标记核素 核素丰度：类似于纯度概念，代表了某示踪物中具有放射性部分的比例，丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。 三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定 标记物：通过直接或间接的化学反应将示踪物质连接到被标记分子上所形成的化合物。 制备高比放射性、高纯度和完整免疫活性的标记物是高质量放免分析的重要条件。 125碘-标记物的制备－标记 125I- 化学或酶促反应，将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子，通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子。 125I或125I+ 125I-标记物 （混合物） Ch-T、LPO氧化 取代反应 直接标记法 三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定 使用无还原剂的高比放射性碘源 被标记物用量要少 ch-T用量要低 控制总反应体积200μl 反应时间1-2分钟 弱碱性反应条件 乳过氧化物酶（LPO）标记法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧，后者使125I-活化成125I2/125I+而取代被标记物分子中暴露的酪氨酸残基苯环上的氢原子。 该法反应温和，可减少对被标记物免疫活性的损伤；酶活性有效期不长，稀释后即可终止反应，易于控制被标记物上125I的数量。 间接标记法 联接标记( bolton-Hunter )预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。 bolton-Hunter 优点；不足之处是标记物的添加基团可能影响被标记物的免疫活性 125碘-标记物的制备－纯化 凝胶过滤法 离子交换层 析法 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 高效液相色 谱法 聚合、损伤物 标记蛋白 游离125I 如标记反应混合液过葡聚糖凝胶G50柱层析，定时/定量逐管收集层析洗脱液，合并标记物峰洗脱液，加入蛋白稳定剂后，分装低温保存。由于脱I-及自身辐射造成