蛋白质分离技术-层析2课件.pptVIP

IEC 离子交换层析 AC 亲和层析 Hydrophobic interaction chromatography（HIC） 疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。 一、疏水层析的原理 不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。 在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。 （一）疏水作用 蛋白质与固定相结合原理 蛋白质表面存在的疏水补丁 蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面 疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合 洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱） （二）吸附剂 根据基质的性质不同分为： 1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成 特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如HPLC等） 二、操作 1.制备层析柱 2.加样与洗脱 3.层析柱再生 * Equilibration 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions Hydrophobic ligand Gel matrix Water molecules * Sample application 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Gel matrix Proteins Hydrophobic groups * Washing out unbound material 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs Non-bound proteins 三、亲和层析的优缺点 1、只需一步纯化步骤，非常简单 2、产物非常纯 ＞95% 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、还可去除已变性或部分降解物质 5、但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制 6、载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化 四、应用 1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理 Ixv_2 JB 980910 * Ion Exchange Chromatography Useful at all stages of purification and at all scales 一、原理 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。 低盐 高盐 分离结束 带电荷 不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质 离子交换树脂如何分离蛋白质 洗脱 树脂 与树脂结合力 二、离子交换剂的类型 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团 （一）按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 —— 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 ——带正电荷，与阴离子交换 ?? 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 胶体 胶体 阳离子交换基 强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂 阴离子交换基 强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素 基质 电荷基团 反离子 商品名 纤维素 —O—CH2——COO- ·Na+ CM-纤维素 纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2 ·Cl- DEAE-纤维素 聚苯乙烯—————S