Western blot详细操作过程.docx

Western BlotWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。实验器材和试剂：蛋白提取试剂1.10% SDS裂解液：称取10g SDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM)0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml)试剂盒RIPA5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml) 0.9848ml 裂解液0.5ml裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM)0.1u