第六章基因操作中大分子的分离和分析.ppt

第六章 基因操作中大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离、检测和纯化 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求） ②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 。 ③无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。 分离核酸应注意以下几点： ①减少化学因素对核酸的降解：酸、碱 ②减少物理因素对核酸的降解：机械力 ③防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 1.1 DNA提取的步骤 一、细胞破碎 二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质 三、除去其他杂质核酸 四、获得DNA样品 一、细胞破碎 目前细胞破碎主要有物理破碎（主要是机械破碎）和非物理破碎（主要化学破碎和生物酶解） （一）、物理破碎 目前常用物理破碎的方法主要有：均质珠子研磨振荡、液氮研磨、乳钵研磨、冻融、煮沸、超声波(ultrasonication)和微波加热(microwave heating)等。 1、微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效，但是加热必须适中，否则DNA可能被破坏。 2、热激处理包含冷冻和融解两步，冷冻主要是用液氮、冰箱(?70℃、－20℃)或冰，而融解主要是37℃、50℃、65℃ 或100℃水浴，其中冻融循环次数和孵育时间可以根据不同要求变化。 如，Lee(1996)等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热激 (?70℃/65℃)联合溶菌酶和SDS处理后的细胞裂解率为90%。 热激处理比其他物理处理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性较好。 3、珠子打击法(bead beating) 加入不同直径的玻璃珠，有利于不同细胞DNA的提取： ①直径为710 ～1180 μm 玻璃珠可打碎土壤块和植物细胞； ② 425～600 μm 玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核细胞； ③ 106 μm 玻璃珠可打碎细菌细胞。 在使用玻璃珠研磨法时，应在珠子大小和数量上具有合适的配比，这样才能有效地破碎和抽提微生物的营养细胞、内生孢子或分生孢子的DNA。 珠子打击法优点：有更好的裂解效率和产量，而且其DNA产量随着打击时间和打击速度的增加而增加，因此，可以用较小的抽提缓冲液体积处理较小的样品得到满意的获得率。 珠子打击法缺点：随着打击处理而增加产量的同时，剪切力增大并导致小片段增加，从而影响PCR的敏感性，甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后的分子生物学处理及结果，特别是引起多样性分析的偏差。 （二）非物理破碎法 非物理破碎法相对比较温和，利于保持DNA的完整性。其主要是包括化学破碎和生物酶解。 1、化学破碎 目前化学破碎法常用的化学试剂主要是阴离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）、Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠）和阳离子型去污剂CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）等。 2、生物酶解 在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶，其主要是通过水解细胞壁而达到裂解细胞的目的，特别是对革兰氏阳性菌的破碎，同时溶菌酶还可以水解糖苷键和腐殖酸的化合键从而改善DNA纯度。 由于生物酶解比较温和，故其常常还需要跟化学、物理等裂解方法联合使用。 目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革兰氏阳性菌裂解的消色肽酶(achromopeptidase)、消化蛋白的蛋白酶K(proteinase K)(主要通过酶解膜蛋白来提高裂解细胞以及消化蛋白而有利于随后的核酸分离纯化)以及在富含有机酸的样品中有利于核酸释放的链霉蛋白酶(pronase)等。 一般来说，单独使用一种处理方法效果都不会很好，而适当的组合可产生很好的效果。 二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质 苯酚对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响； 氯仿也可使蛋白质变性，对DNA无影响； 蛋白酶可降解蛋白质，故在实验中也常使用。 注：苯酚的残留会严重干扰后续的分子操作，故用苯酚去除蛋白质后还需用氯仿/异戊醇（24:1）抽提两次，以去除残留的蛋白质和苯酚。 三、除去其他杂质核酸 在DNA提取中会有少量的RNA杂质残留，但RNA极易降解，一般情况下对后续的DNA操作无大影响。如要求DNA纯度较高时可加入RNA酶（RNase）以降解RNA。 四、获得DNA样品 含DNA的水相可用以下几种沉淀剂沉淀： a. 无水乙醇（最常用）：易于从DNA沉淀中除去。但所需的体积大（2倍），由于使用的管多为 一次性，比较浪费。 b. 异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA的水分子，使 DNA沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为0.6—1倍体积，但不易除去，需用70%酒精洗涤几次，否则对后续分子操作有影响。异戊醇：几乎不能与自由水结