DNA重组的操作.ppt

第六章 DNA重组的操作 第一节 DNA的体外重组 1、粘性末端的连接 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 　（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 　 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 　2. 平头末端连接 　（1） 直接连接 　　 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 　　　 第一节 DNA的体外重组 　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” 　　 a）同聚加尾 法 　　　 DNA末端转移酶 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸, 利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 　　 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 还有哪些方法能够创造粘性末端？ 第一节 DNA的体外重组 b）衔接物(linker)连接 　　　Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 　　 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 第一节 DNA的体外重组 平头末端连接 （1） 直接连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法 第一节 重组DNA分子的构建 　3.PCR产物的连接 　（1）在引物的5’端设计酶切位点 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 　（2）与T载体直接连接 　Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3’端一般都有一个A 　　　T载体的两个3’端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！ 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 （1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 （2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 2. 平头末端连接 （1）直接连接 （2）人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法 3. PCR产物的连接 （1）在引物的5’端设计酶切位点 （2）与T载体直接连接 思考： DNA体外连接应注意哪些事项呢？ 第一节 DNA的体外重组 　二、DNA体外连接应注意的事项 　　1.插入片断与载体的酶切位点互补 　　　相同的粘性末端才能有效地连接。 　　　尽量避免平端连接。 第一节 DNA的体外重组 2. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 第一节 DNA的体外重组 　（2）起始密码 　　　尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 　 　　3. 防止载体自身环化连接 　（1）提高插入片断的用量 　　　　连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 　（2）用碱性磷酸酶处理载体 　　　载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。 三、载体和外源DNA插入片段的连接结果 第一节 DNA的体外重组 BamHI BamHI Sau3AI （1）用相同的酶切 （2）用同尾酶切 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 双酶切 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI ATG G AA TTC 载体 ATG CGG AAT TCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATG G AAT TCT 重组 但移码突变！ 2. 载体自身环化连接（能存活） 3. 载体之间互相连接（能存活） 4. 插入片段互相连接（不能存活） 1. 一个载体与一个插入片段重组（能存活） 6. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 5. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 生命科学学院 * 外源