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SMA分子检测进展 董欣 生物化学与分子生物学 21620101152298 进行性近端型脊髓性肌肉萎缩症，简称脊髓性肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy）,SMA SMA属于常染色体隐性遗传病，发病率为1//6000-1/10000。 临床上根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型 Ⅰ型（Werding-Hoffman病），又称严重型SMA、急性型SMA、婴儿型SMA，一般在两岁之前死亡 Ⅱ型，又称中间型，是一种中等程度的SMA，大多仅能存活两年 Ⅲ型（Kugelberg-Welander病），又称成人型，属于轻型脊髓性肌萎缩症，其发病年龄从一岁半至成年 SMA相关基因 运动神经元生存基因——SMN SMN基因定位于5号染色体长臂1区(sqll.2一13.3) 近端粒SMNt(SMN1) 近着丝粒SMNc(SMN2) 两者之间仅存在5个碱基的差距 现有的分子诊断方法 半定量PCR FISH 荧光实时定量PCR PCR-RFLP PCR-SSCP MLPA 多重PCR结合DHPLC等。 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP） PCR扩增特定靶序列 将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开 PCR-RFLP法是一种简单、快速的诊断方法 PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。 在差异碱基相邻处通过反向错配引物引入错配位点T(原序列为C)，从而在SMN2的PCR产物中形成1个特异的DraI酶切位点 通过Dral对SMN1与SMN2的第7外显子PCR产物进行直接酶切以区别SMN1和SMN2 SMN1的第7外显子PCR产物 (189bp)不被酶切，而SMN2的第7外显子的PcR产物可被酶切，变成 165bP和24bP片段。 展望 SMA分子诊断方法的多样性证明，每种分子诊断方法都不可避免地会有它自身的局限性。 SMA分子诊断技术尚有待进一步完善。 相信随着SMA基因检测的广泛开展，SMA分子诊断(包括产前基因诊断和植入前基因诊断)的准确性将进一步提高，从而为SMA患者家庭提供更可靠的遗传咨询和风险预测，降低出生缺陷的发生。 The end,thank you! * * * * * 多重连接探针扩增技术 MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。 SMA患者SMN1基因具有第7, 8号外显子的缺失，而SMN2未见缺失 以PCR-RFLP为例，酶切不完全和PCR扩增时形成SMNI和SMN2之间形成的异源双链都会造成假阴性结果;扩增阻滞PCR也存在非特异扩增和扩增失败等问题。 应用PCR-SSCP技术检测SMA 应用PCR-RFLP法诊断SMA * * * 多重连接探针扩增技术 MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶