第七章核酸提取与鉴定课题.pptVIP

1、植物样品 新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗； （二）提取用具预处理 二、真核生物基因组DNA的常规提取 2、除去杂质（主要是蛋白质） （SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）——苯酚抽提蛋白质——氯仿抽提、萃取苯酚 经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。 基因组DNA－CTAB法 基因组DNA－SDS法 三、质粒DNA的提取 离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。 四、RNA的提取 （一）总RNA的提取 常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。 异硫氰酸胍：可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。 RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。 （1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。 玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。 （2）RNA提取中RNase污染的控制 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 RNA的提取方法 1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法 使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性； 再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。 这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞染色体DNA。 2、盐酸胍-有机溶剂法 利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶； 4、一步快速热酚抽提法 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离； 用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。 此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。 裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性； 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA； 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA； 此法操作简便快速。 （二）mRNA的提取 从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱mRNA。 （一）核酸浓度检测 （二）核酸纯度检测（紫外吸收法） 核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸收峰 核酸的纯度用OD260/OD280比值表示。 （三）核酸完整性检测 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 琼脂糖凝胶电泳有许多优点： 操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广； 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好； 电泳后区带易染色，便于定量测定； 可用于核酸的纯化和分离（电洗脱法）； 可制成干膜可长期保存。 RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。 在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。 RNA变性电泳： RNA为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。 只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。 方法： 电泳前样品保温60℃， RNA分子伸展。 凝胶中加有甲醛，使RNA在电泳过程中保持单链结构。 操作流程大致为： 凝胶的制备→加样→电泳→染色→观察和拍照 上样缓冲液： 常用的电泳缓冲液 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，主要用于分子量小的DNA的分离，或在DNA测序中使用，操作复杂。 Trizol一步提取总RNA： TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。 异硫氰酸胍