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2011-04 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：一株真菌的分子鉴定 试验人员：孙大光 试验负责： 报告日期：2011年04月 计数月份：2011年04月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计不足，实施错误 6%-10% 设计不全，实验无果 11%-15% 设计可以，实施不全 16%-20% 设计完整，分布实施 21%-25% 实验不全，记载无果 26%-30% 实验不足，记载不全 31%-35% 独立实验，记载不全 36%-40% 分布实验，记载完整 41%-45% 目的明确，实验完成 46%-50% 实验完整，记载清晰 51%-55% 实验系统，结果可信 56%-60% 实验创新，分析清晰 61%-65% 实验创新，结论清晰 66%-70% 实验完整，统计清晰 71%-75% 实验系统，数据可靠 76%-80% 报告完整，文章雏形 81%-85% 结构合理，分析有据 86%-90% 逻辑清晰，统计合理 91%-95% 图表完整，写作流畅 96%-100% 文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 1．试验目的 真菌核糖体基因转录间隔区（internal transcribed spacer）ITS又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA （rDNA）上18S和28S基因之间的区域片段主要包括内转录间隔区1 ITS1、5.8S rDNA内转录间隔区2 ITS2其两侧分别是18S rRNA基因和28S rRNA基因虽然ITS1和ITS2是核糖体转录单位中的一部分但这些序列并不转录成RNA它们只是在核糖体RNA成熟过程中起着重要作用。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性在种间则保持着各种程度的变异变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近最常见的变异是ITS上的单个碱基的替换其次是碱基的插入或缺失与核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列相比较ITS1和ITS2作为非编码区承受的进化选择压力较小相对变化较大在种间表现出较高的差异可以为研究真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息Gonzalea于1990年提出利用ITS作为全新的分子标记由于该分子标记技术具有快速准确微量灵敏度高程序简单等优点现已广泛应用于真菌的分类鉴定检测和病害诊断。 本实验采用ITS4 /ITS5引物将一株真菌的部分ITS DNA序列扩增出来，然后进行测序，NCBI比对，初步鉴定这株真菌。 2．试验方法 2.1 真菌DNA的提取--尿素提取法 ①称取150mg研磨的真菌6XW菌丝样品与1.5ml灭菌离心管中，加入800μl尿素提取缓冲液（7mol.l-1 Urea，50 mmol.l-1 Tris-HCl pH 8.0，62.5 mmol.l-1 NaCl，20%SDS）摇匀后加入12000r.min-1离心5 min，吸取上清液12000r.min-1再离心5 min； ②将上清液移入到另一个新离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1v）溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r.min-1离心5 min； ③取上清液到另一个新离心管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 mol.l-1 NaAc溶液（pH 5.2），-20 ℃放置20 min； ④12000r.min-1离心5 min，弃上清，倒置使管壁液体流尽； ⑤加70%无水乙醇漂洗两次DNA沉淀，离心1 min，弃上清，室温风干挥发乙醇。加入50μl灭菌水溶解，放置4 ℃冰箱过夜溶解； ⑥-20 ℃保存。 2.2 PCR扩增 （1）PCR反应体系 反应的总体积为25 uL，含有Buffer 2.5 uL ，dNTP 0.5 uL，10 uM·L-1ITS4/ITS5引物各1 uL，Taq酶0.25 uL，DNA1uL，ddH2O18.75 uL。 （2）PCR反应程序 94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃最后延伸10 min。 （3）引物序列 ITS4：5-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3 ITS5：5-GGAAGT AAAAGTCGTAAC AAGG-3 2.3 琼脂糖凝胶电泳 配制1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物与1 μL DNA载样缓冲液混匀上样