第二讲 病原诊断的一般步骤.ppt

第二讲 病原诊断的一般步骤及方法 优点 直接、快速，有利于为防制赢得时间。 不足 只能做初步的定性，不能确诊，特别是不能对病原定型。 三 、病原分离 1 细菌分离 （1）使用不同培养基 如鸡大肠杆菌以麦康凯培养基、鸡白痢用SS琼脂，禽霍乱用血琼脂进行分离。 （2）不同的培养条件 如分离炭疽要在需氧条件下进行，而分离破伤风梭菌却要在严格的厌氧条件下进行。 （3）污染样品要注意增菌 如用含胆盐的培养基可用于沙门氏菌的增菌培养，低温可用于李氏杆菌的培养，链霉素可用于革兰氏阳性菌的培养。 2 病毒分离 （1）要使用敏感的细胞或禽胚 （2）细胞或禽胚不能有内源性污染 （3）初次分离要盲传3代以上。 四、病因推断 根据koch和Evans病因假说进行。 1 Koch假说 （1）病原存在于该病的所有病例中 （2）它不作为偶然性和非致病性寄生物存在于其它疾病中。 （3）病原可从患该病的动物体内被分离成纯培养，反复传代，并能在易感动物体内复制该病。 2 Evans假说 该理论1976年提出，其认为疾病是由多因素引起的，是一种多元病因理论。该假说考虑到致病因子、环境因素以及宿主因素在影响疾病分布过程中的相互作用。 五、常用病原鉴定方法及原理 1 微生物学鉴定 （1）细菌培养特性、染色、生化实验 （2）病毒培养特性、电镜观察 如细胞病变、空斑观察、病毒形态等 2 动物实验 （1）鸡胚接种 （2）易感动物复制疾病 3 血清学鉴定 （1）凝集实验 玻板凝集实验、试管凝集实验、间接血凝、乳胶凝集实验 （2）沉淀实验 琼脂扩散实验、免疫电泳 （3）免疫标记技术 ELISA 包括直接ELISA、夹心ELISA、Dot-ELISA 免疫荧光技术 免疫组织化学 放射免疫测定 （4）中和实验 以细胞、鸡胚、动物进行的中和实验 （5）补体结合实验 原理：包括2个反应系统：检测系统，即已知抗原（或抗体）、被检抗体（或抗原）、补体，指示系统，及绵羊红细胞、溶血素。抗原与相应抗体结合后，激活补体，并结合在抗原抗体复合物上被固定，不再游离存在，加入绵羊红细胞指示系统后，不发生溶血现象。否则发生溶血现象。 该方法特异性好，是OIE法定检测方法，但操作繁琐。 （6）免疫层析试纸条 原理：利用抗原抗体反应原理，以条带状在NC膜上预先固定好特异性的抗原（或抗体）和第二抗体作为捕获剂，分别作为实验带（test line）和 控制带(control line)。反应物是固定于胶体金结合垫上并标记了抗待测物抗体的胶体金颗粒。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂，后相互反应形成复合物。复合物再通过毛细作用移动至t区时，预先固定的抗原（或抗体） 与金标试剂的复合物再发生特异性抗原抗体反应而被截留在t带上，并显示出颜色。因此可根据颜色的深浅或有无来判断待测物。 4 分子生物学鉴定 （1）PCR 基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 （2）探针杂交 基本原理是利用DNA与DNA 、RNA与DNA互补配对的原理来进行。在NC膜上进行，southern、northern blot （3）指纹图谱分析 细菌、病毒基因组经特定的限制性内切酶酶解后，出现特定的电泳条带，可用于病原的分析 （4）多酶电泳 细菌胞内有许多种蛋白酶，提取后经蛋白电泳，呈现不同的图谱，可用于细菌的鉴定 （5）蛋白质芯片 （6）基因芯片 基本原理： 是将合成的核酸探针或抗体通过阵列器（arrayer）点样于固相支持物表面（NC膜或硅片），可与放射性