4第4章 DNA重组课件.ppt

第四章 DNA重组 一、同源重组 (一) Holliday模型 (二) 细菌的基因转移与重组 (三) 重组有关的酶 二、 特异位点重组 三、 转 座 重 组 (一) 细菌的转座因子 (二) 真核生物的转座因子 Hello! 　　由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，并水解ATP。一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上，位于交叉点上游。 　RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动速度约为10～20 bp/s。同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。 　RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定 图4-4 Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型 　结果是片段重组还是拼接重组，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也已在真核生物中发现。在酿酒酵母中的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者的功能有关。该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。 特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20～200 bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助 　因子对其识别和作用。特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合(图4-5)。 图4-5特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。A重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。B重组位点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合 位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究中发现的。λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基本特征：①交换是相互的和保存原先的DNA，是典型的保守性重组（conservative recombination）；②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列 中的专一性核苷酸上，在高等生物细胞中，最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除。 λ噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状态需要λDNA整合（integrate）进宿主DNA，噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分；由溶源状态进入裂解状态需要λDNA从宿主DNA上切除（excise）下来，λDNA在宿主细菌中 以环状分子独立存在。这里，整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组而实现。这些特定位点叫附着位点（attachment site或att）。细菌的附着位点称attB，由序列B、O和B’组成，噬菌体的附着位点称attP，由序列P、O和P’组成。其中B、B’、P、P’的序列各不相同，而O序列是attB和attP所共有的，图4-15说明在这些位点处发生的重组反应。 整合 BOB’ 图4-15 λ噬菌体的位点专一性重组 Int 切除 Xis IHF POB’ attR BOP’ attL 原噬菌体DNA Int IHF 细菌DNA 噬菌体DNA attB attP POP’ + 由于噬菌体DNA是环状的，在重组过程中，它以线性形式插入细菌染色体中，此时原噬菌体被重组产生的两个新att位点所固定。所以，形成这两个新的附着位点attL（BOP’）和attR（POB’）是很重要的，这样可以使整合和切除反应不在一对相同的反应序列之间发生。整合过程要求在attB和attP之间进行识别，而