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实验八 重组子鉴定 实验目的 了解转化子鉴定原理，掌握各方法适用的情况 酚/氯仿快速抽提、酶切鉴定上次实验的转化子 实验原理 基因组获得基因： 构建基因文库 筛选特定基因 得到经过鉴定的重组子才完成了一个完整的克隆过程 重组鉴定可从以下水平进行： DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位杂交 Southern杂交 DNA顺序分析 mRNA水平： 蛋白质水平： 免疫沉淀检测法 功能水平： 抗性反应 显色反应 常用鉴定方法 小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 ?互补 杂交筛选 酚/氯仿快速抽提、 酶切鉴定转化子 实验步骤 挑选阳性克隆子培养 抽提质粒 酶切 电泳鉴定 质粒提取 1.5mL过夜培养菌液 倒入EP管中,12000g,1’,离心 弃上清, 涡旋振荡器振松菌块 加入100uLTE, 混匀 加入100uL酚/氯仿混匀 12000g, 5’,离心 吸取上清移入新的EP管中 12000g离心10’ 弃上清, 加200uL70%乙醇洗涤 12000g离心2’, 干燥 沉淀溶于10uLTE(RNase)中 酶切 取3-5uL在10-20uL体系中进行EcoRI酶切反应 质粒 5xBufferH EcoRI 1.0 uL ddH2O 37°C 温育40’ 电泳检测结果 1%琼脂糖凝胶, 120v电泳 ?-互补 载体：带有?半乳糖苷酶的启动子及其编码?肽链氨基端的DNA序列--lacZ’基因 这个编码区中了一个MCS，它不破坏读框，不影响功能 宿主菌：编码?半乳糖苷酶C端部分序列 分别编码的片段均无活性，但可融为一体，形成具有酶活的蛋白质-- ?-互补 X-gal存在下形成蓝色菌落 当有外源片段插入载体时，导致无?-互补能力的氨基端片段，形成白色菌落 * * 酶切和电泳方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析 转化子的分析——Southern杂交 加入100uL氯仿/异戊醇混匀 12000g, 3’,离心,吸取上清移入新的EP管中 加1/10体积NaAC, 2V体积无水乙醇, 混匀 0°C, 沉淀15’
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