第20章 重组DNA技术课件.ppt

* * 第七节重组DNA技术的应用 Application of recombinant DNA technique 自习 重组DNA技术的主要应用 (1) 克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与功能，表达具有生物学活性的蛋白质； (2) 利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造； (4) 开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗； (3) 利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型； (5) 建立基因诊断、鉴定与基因治疗的新方法。 学习要求 1.掌握重组 DNA 技术的相关概念、基本原理和主要步骤。(ppt3) 5.熟悉重组体导入受体细胞及筛选方法。(ppt74) 2.掌握限制性内切酶概念及作用特点。(ppt9) 3.熟悉常用载体及特点。(ppt35) 4.熟悉目的基因获取及与载体连接的方法。(ppt57) 6.了解基因克隆表达技术，原核、真核表达系统的优缺点。(ppt86) * 左下角处有超级链接到配伍末端 * 限制酶切位点 限制酶消化 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~7 Kb DNA 片段 cos L R cos ~7 Kb 外源 cDNA 片段 cDNA文库 λgt10/11系列 (插入型，适用于cDNA克隆) c DNA 片段 * * gDNA文库：g-文库 cDNA文库：c-文库 方法： 用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。 3. 从基因文库中筛选目的基因 * * Screening a genomic library by colony hybridization. Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶，15oC + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 目的基因自连 载体自连 二、目的基因的体外重组—接 （一） 黏性末端连接 1. 同一限制酶切位点连 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ双酶切 T4 DNA连接酶，15oC 重组体 2. 不同限制酶切位点连 * * 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶，15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 （二）平末端连接 * * Eco RⅠ CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 (三）人工接头(linker)连接 * * 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 3′ A(A)nA A(A)nA3′ 5′ 5′ （四）同聚物加尾连接 * * PCR扩增 + 3′ 3′ 5′ PCR产物 A A 5′ T载体 T T 5′ 5′ 3′ 3′ 连接 转化 蓝白筛选 Taq酶 (五）T-A克隆 * * * * Inporting, Screening and Verification of Recombinant DNA 第五节重组DNA分子的导入和筛选与鉴定 一、重组DNA分子的导入 — 转 宿主细胞应具备的特征： ① 处于感受态 ② 对载体无严格限制 ③ 限制酶和重组酶缺陷 ④ 不对外源DNA进行修饰 ⑤ 能表达重组体所提供表型特征 将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。 * * （一）转化(transformation) 指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12突变株低渗CaCl2,0℃处理进入感受态。 （二）转染(transfection) 指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA 分子导入真核细胞的过程。 （三）感染(in